实验三 沿阶草炭疽病的病原鉴定及病害调查

沿阶草，又名书带草、不死草、麦门冬、铁韭菜、细叶麦冬、蒲草、绣墩草，属百合科沿阶草属，学名： Ophiopogon japonicus cv．为多年生常绿草本。根状茎短粗，具细长匍匐茎，有膜质鳞片。须根端或中部膨大成纺锤形肉质块根。叶线形，丛生，长10～30cm，宽0.4cm左右。在野外，沿阶草常生于沟旁及山坡草丛中，喜半阴，湿润而通风良好的环境，耐寒性强[1]。在人工绿化上，沿阶草可作花坛边缘材料和地被植物，布置在山石旁、庭园、台阶下或沿路两旁栽植。也可盆栽观赏。沿阶草抗性强，不易发生病虫害，无论盆栽或地栽均较简便，无需精细管理。因此沿阶草由于经常做为草坪绿化植物之一，具有很强的经济价值。

在病害调查过程中，于福建农林大学病毒所附近、北区1#楼后、北区2#楼后等楼旁的草坪中发现沿阶草的一种常见叶部病害，虽然为害不严重，但是防治不严格可能会导致整片草坪得病，也降低了其总体的观赏性。本实验针对这种病害展开调查，鉴定其病原为炭疽杆菌，并探讨该病害的发病特点与防治措施。

1 调查地点与调查方法

1.1调查时间：2009年11月24日——11月24日（周二病理实验课课前）

1.2 调查地点：福建农林大学北区1#楼后沿阶草草坪，

1.3 调查面积：6米×50米

1.4 症状观察与病原鉴定：到草坪中采集发病植株标本（图1），观察沿阶草发病实状，并对症状特点进行数码摄影、病害病原分离培养、纯化、镜检，同时通过切片，在显微镜下观察病原形态特征，并进行显微拍照，比对分离培养的病原形态特征，参考书籍文献，确定沿阶草叶片焦黄的发病病原。

分离纯化的具体操作是切取沿阶草病、健交界处的病组织一小块（约0.2CM左右），先置于70%乙醇中浸3～5s，接着再把病组织移入0.1%升汞中浸1.5min，然后再把病组织移入灭菌水中漂洗3遍，最后把病组织移到PDA平板培养基上培养。一段时间后，切取菌落颜色较一致的边缘菌丝约5×5mm至新的PDA平板培养基纯化培养[2]。并拍摄培养皿的病原菌落的图片。

① ②

③

④ ⑤

图 1 病害标本采集地点

1.4 发病率与病情指数：

五点取样，以该草坪四角以及草坪中间各取一片面积为20×20CM的草坪面积，每点约9株，以这五点进行病情调查。

发病率公式为：发病率（%）=（调查病叶数×100％）/调查总叶数

根据症状特点进行病情分级：

病情指数公式：病情指数=∑[各级叶数×该级代表值]×100/[调查总叶数×最高级代表值]

病情分级为0、1、2、3、4、5级，具体分级标准如下（图2）：

0级：健叶，无任何病斑或病斑极其微小

1级：病斑淡黄色，尚未形成褐色斑纹，病健交界处不明显。发病部位占叶面积少于5%

2级：病斑形成褐色斑纹，附近形成黄色晕条，病健交界明显。发病部位占叶面积6～10%

3级：病斑形成褐色斑纹，附近形成黄色晕条，病健交界处明显。叶尖枯焦，发病部位占叶面积11～20% 

4级：病斑形成褐色斑纹，附近形成黄色晕条，病健交界处明显。叶尖枯焦，发病部位占叶面积20～30%

5级：病斑形成褐色斑纹，附近形成黄色晕条，病健交界处明显。发病部位至叶尖均枯焦，整片叶几乎枯死。发病部位占叶面积大于30%

图2 沿阶草炭疽病分级标准示意图

2 结果

2.1 症状观察

叶片受害，初为红褐色小圆斑点，后变为圆形、近圆形、椭圆形等不规则形病斑，中央初期为灰白色，后发展为灰黑色，边缘有红色或紫色晕圈，病部和健中交界不明显（图3），直径1～10mm，病部产生黑色小点(图4)。我校明德楼前的花圃部分苗株发病严重，病害症状表现明显，发病率相对较高（图5）。

图3 千日红斑点病局部观

图4 千日红斑点病病斑示小黑点

图5 沿阶草发病植株整体观

据文献报道，千日红常见病害为链格孢叶斑病，其症状与此次我们调查的病害症状具有一定的相似性，但其差别表现在链格孢叶斑病病部产生灰褐色霉层[3]，而不是黑色小点。

2.2病原鉴定

千日红斑点病病原为壳二孢(Ascochyta chrysanthemi F.L.Stev)。取切片镜检，分生孢子器褐色，圆形至扁圆形，初埋生，后暴露，单个或分散，孔口小（图6）。分生孢子椭圆形或长圆形，无色，双细胞，1隔膜，但隔膜常不清楚，分隔处稍缢缩，顶钝，每细胞有1或2油球，6～1um×3～4um[4]（图7）。

图

图6 分生孢子器

图7 壳二孢子形态图

经过切片显微观察后，选择新近发病的病叶作为分离材料，并在病、健交接处选材取样进行病原分离，再纯化培养（图8），其性状基本符合壳二孢属的生长性状，显微镜检，比对切片所获得的病原，参考书籍、文献等相关资料，最终确定千日红斑点病的病原。

图8 纯化培养的菌落

2.3 发病率与病情指数

根据对角线取样原则抽取10株，具体数据记录如下（表1），并用柱形图表形象表示各级病害比率（图9）：

发病率（%）=（446-174）×100%/446=60.99%

病情指数=（174×0+120×1+64×2+48×3+21×4+19×5）×100/（446×5）=25.61

表1 千日红斑点病病害调查数据记录表

图9 千日红斑点病各级病害比率柱形示意图

3 分析与讨论

3.1 病原鉴定

切片玻片显示壳二孢属分生孢子椭圆形成长圆形、无色、双细胞、每细胞有1或2油球（滴）；分生孢子器褐色，圆形至扁圆形、分散、埋生、器壁薄；分离培养的菌落、子实体性状、质地与切片获得的壳二孢属所表现性状基本吻合。但是通过书籍、文献检索发现，目前国内学者针对千日红斑点病的研究及发表的论文不多，加上实验条件有限，并没有将纯培养物接种到健康植株上验证，没有完全按“柯赫法则”鉴定，因此是否真为壳二孢属所致的千日红新病害——千日红斑点病还有待进一步求证。

3.2发病原因

（1）气候条件：病菌分生孢子的形成、萌发和侵染均需较高的温度和湿度，千日红在夏秋之际开放，此时气温较高，若降雨多，则发病就重。

（2）栽培管理：病菌存活在植物残体上，借助气流、昆虫、雨水传播，可直接从气孔处侵入危害[5]。土壤肥力差，生长衰老，分枝稀少的植株斑点病发生重。肥料充足，枝叶茂盛的植株斑点病发生轻。

3.3发病规律

病菌以菌丝体和分生孢子在病叶和种子上越冬。次年分生孢子借风雨传播。高温多雨，栽植过密，浇淋水过多，均有利于发病。

3.4防治措施

千日红斑点病的有效防治方法如下：

①选抗病品种。花卉供应商在培育千日红植株时，加强千日红抗病品种选育，提高抗病性；

②改良土壤。改善栽培条件，保证土壤肥料供应，改良土壤，增强千日红的抗病能力。

③加强花木养护管理。如及时清除病残体；合理密植，尽量避免连茬种植；适量修剪；适时修剪，增强通风透光度[6]；避免大水漫灌，适时追肥。

④土壤处理可采用氯化苦熏蒸，有效杀死病原菌，从基质上减少菌源积累量。

⑤发病初期可喷洒75%百菌清可湿性粉剂500倍液，或70%代森猛锌500倍液，或50%甲基硫菌灵可湿性粉剂600倍液，或50%多菌灵可湿性粉剂800倍液，或77%可杀得500倍液，40%敌菌酮500倍液，40%大富丹500倍液交替使用，隔7～10d一次，连防2～3次。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社.2006.25(2):238

[2]许文耀. 普通植物病理学实验指导[M]. 北京：科学出版社,2006:59-73

[3]张忠义、丁梦然、雷增普.花卉病虫害防治大全[M]. 北京：中国农业出版社,2003:167

[4]谢联辉.普通植物病理学[M]. 北京：科学出版社,2006,(8):121

[5]傅新生、何芬、傅放.庭院观花植物病害防治[M]. 天津：天津科学技术出版社,2008:88-92

[6]丁梦然. 园林花卉病虫害防治彩色图谱[M]. 北京：中国农业出版社,2006:134

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