人类免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp41的 基因重组表达

    【摘要】　目的　基因重组表达(HIV-1 gp41)抗原，并研制一种快速、简便、灵敏性高、特异性强的国产HIV-1免疫检测试剂。方法　选用HIV-1型BH10毒株的包膜糖蛋白gp41的部分基因(6977-7497),重组在PBV221表达载体上。表达产物通过15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离纯化，根据RF值，切下含特异蛋白的胶带，以Western blot法转移在硝酸纤维素膜上；免疫血清法检测合格者制备的抗原检测条带，经国家标准参比血清检测。结果　获得1株含HIV-1 gp41基因的重组质粒，其蛋白的特异性表达为8%，经HIV-1阳性血清检测和国家标准参比血清检定，该表达蛋白灵敏性、特异性均为100%。结论　(1)可以选用单一的gp41作为HIV-1感染初筛试剂的抗原。(2)表达载体PBV221其表达的目的蛋白为非融合蛋白，作为试剂中的抗原，可降低检测中的非特异性。(3)该试剂是一种简便、特异、灵敏性高的试剂。
　　【主题词】　HIV-1　　基因重组　　gp41　　免疫检测试剂

Expression of recombinant HIV-1 envelope glycoprotein gp41　TENG Zhiping, LI Degui, GAO Liansheng, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050
　　【Abstract】　Objective　To construct and express HIV-1 env gp41 gene for develoing a simple and rapid test for HIV-1 infection. Methods　HIV-1 env gp41 gene of BH10 strain (nt6 977-7 497) was constructed into expressing vector pBV221 and expressed in E. Coli HB101. The expressed proteins were purified on 15% SDS-PAGE, the specific protein gel was cut down, transferred onto nitrocellulose membrane and stained with ponceau for 10 minutes. The membrane was detected with positive and negative serum respectively. The membrane was blocked with blocking buffer and cut into 2 mm of each strip and fixed into the well of thin plastic plate.Results　We obtained a strand plasmid expressing HIV-1 env gene and the protein.Conclusion　The results showed that:(1)HIV-1 env gp41 protein can be used to detect HIV-1 antibody in serum of individual; (2)The expressed protein is a nonfusion protein and has high specificity and sensitivity to HIV-1.
　　【Key words】　HIV-1　　Gene recombination　　gp41　　Immune detection reagent

　　人类免疫缺陷病毒(HIV)在感染后的2～4周，血清中出现HIV特异性抗体［1～3］。应用免疫血清学方法，早期可检出抗核心蛋白p24及其前体p55和gp41的抗体。随后可发现抗包膜糖蛋白的gp120/gp160的抗体，但随着病情的进展p24抗体会逐渐下降，甚至消失。根据HIV感染后的血清学变化，我们选择了gp41为HIV-1的诊断试剂抗原，对其基因进行重组在PBV221温控表达载体上，在大肠杆菌中表达。
　　gp41位于HIV-1包膜糖蛋白的gp160的基因编码区，第四开放读码框架之内，共含350个氨基酸残基，其前体为包膜糖蛋白的gp160，经蛋白酶裂解成gp120和gp41，分别形成成熟病毒颗粒的表面棘突和跨膜部分。位于表面的部分，可刺激机体产生相应的抗体，本研究选用的gp41内的抗原决定簇，位于BH10毒株基因7 345-7 423，编码23个氨基酸残基［4］。
　　PBH10质粒含有BH10的全基因，经BglⅡ和HindⅢ核酸内切酶消化，回收的0.52 kb(6 977-7 497)基因片段重组在PBV221表达载体上。PBV221表达载体全长为3.66 kb，含有很强的启动和终止密码及诱导表达基因，氨苄青霉素为抗性选择标记基因，通过BamHI(与目的基因上的BglⅡ酶为同工酶)和HindⅢ酶切位点插入了目的基因。

1　材料和方法

1.1　材料　含有HIV-1 BH10毒株全基因组质粒为本室提供。基因表达载体PBV221由本所基因工程室赠送。核酸内切酶购自华美生物技术公司。0.45 μm的硝酸纤维素膜购于BioRAD公司。SPA-辣根过氧化物酶结合物为本室标记。底物TMB购自Genemed、Biotechnologies公司。HIV抗体阴性对照血清来自正常人血清，用蛋白印迹及ELISA法检测，HIV-1+2抗体均为阴性。HIV-1抗体阳性对照血清来自我国云南吸毒HIV-1感染阳性者血清，经ELISA和Western blot法检测抗体为阳性，56℃30分钟灭活，作为阳性对照。国家HIV标准质控参比血清，购于中国药品生物制品检定所。
1.2　方法［5］
1.2.1　HIV-1 gp41抗原基因的重组　将PBH10毒株基因组DNA用核酸内切酶BglⅡ消化酶切，0.8%低融点琼脂糖凝胶回收1.43 kb DNA片段(6 977-8 407)，经BamHI酶解PBV221质粒载体，S1核酸酶分别修平BglⅡ粘性末端和PBV221载体的BamHI酶解的粘性末端，成为平头。HindⅢ核酸内切酶酶解上述修平的片段的载体片段，低融点琼脂糖回收0.52 kb片段，回收的0.52 kb基因片段经T4连接酶连接，重组在PBV221的载体上。重组质粒转化到致敏态的HB101受体菌，LB固体培养基上培养过夜。
1.2.2　重组质粒的鉴定核苷酸顺序分析　挑选单菌落LB培养液中培养，小量质粒提取，经HindⅢ酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　提取纯化重组的阳性质粒，ABI核酸自动测序分析仪进行序列分析。
1.2.3　重组质粒gp41基因的表达　挑选经测序分析重组正确的阳性单菌落，接种于5 ml加氨苄青霉素的LB培养液，30℃震荡过夜，次日晨转到50 mlLB培养液中，30℃摇菌测OD值(约为0.6)，调温到42℃诱导4小时，使蛋白表达，4 000 r/min离心20分钟，收集细菌，沉淀加TG缓冲液(10 mmol Tris-HCl，10%甘油)100℃煮10分钟，样品于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品一式两份，一份考马斯亮蓝染色表达分析蛋白产物，另一份分析抗原性。
1.2.4　重组表达gp41蛋白抗原性的检测　按Western blot法转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色检测转移的蛋白，将载有抗原蛋白的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜(封闭液；0.01 mol/L PBS pH7.4，0.2%Tween-20，3%牛血清蛋白)，以不同稀释度的HIV-1抗体阳性血清免疫血清法检测表达蛋白的抗原性。加阳性血清：37℃，30分钟；PBS洗10秒钟×3次加HRP标记的二抗；37℃，30分钟，PBS洗10秒钟×3次加入底物液：
　　2滴底物缓冲液加入1滴底物液(H2O2+TMB)观察结果。
1.2.5　检测试剂条的制备
　　(1)抗原的制备：取经检定阳性的甘油保存菌种1支，接种到5 ml加氨苄青霉素的LB培养液中，30℃振荡过夜。次日晨转入50 mlLB中 ,30℃振荡约4小时，测OD值在0.5，调温到42℃，继续培养4小时，诱导蛋白的表达。4 000 r/min离心20分钟，收集细菌。将沉淀按1∶16的原体积加入30 μlTG buffer(10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 10%甘油)充分混匀，加30 μl蛋白样品buffer(3%蔗糖，2%SDS，5%巯基乙醇，20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 溴酚蓝)混匀，煮沸10分钟，备电泳用。
　　(2)15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白：制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶板30 cm×20 cm，按每厘米1 μl加上述制备的样品，15 mA电泳16小时。根据标准蛋白分子量marker和Rf值及溴酚蓝下缘长度计算gp41的位置，上下各宽1 cm，切下特异的胶带。按Western blot法转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色3分钟，检测转移蛋白效果。置于封闭液中，4℃过夜。膜封闭后，自然干燥，切割成3 cm×10 cm的条带。双面胶将抗原条固定在反应槽内，每槽1条。
　　(3)抗原条特异性和敏感性的检测：按国家HIV-1标准，参比血清试剂盒操作说明，检测制备的抗原条。

2　结果

2.1　HindⅢ内切酶酶切鉴定的重组质粒，经0.8%琼脂糖凝胶电泳比较，获得了4.1 kb的重组质粒(1，2)。
2.2　重组质粒经373A型核苷酸序列测定仪测定(反向测序)核酸序列(3)，分析含有gp41抗原决定簇的编码23个氨基酸残基的264-334核苷酸序列。
　　GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG
　　Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp
　　GGT TGC TCT GGA AAC CTC ATT TGC
　　Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys
　　ACC ACT ACT GTG CCT TGG AAC
　　Thr Ala Ala Val Pro Trp Asn

1　重组质粒的鉴定(0.8%琼脂糖凝胶电泳)
1.DNA/HindⅢ Marker; 2.PBV221; 3.重组质粒(pBV221+0.52 kb); 4.重组质粒经HindⅢ酶切
Fig.1　Confirmation of the recombinant plasmid
(0.8% agarose gel electrophoresis)
1:DNA/HindⅢ Marker. 2:Plasmid pBV221. 3:Recombinant plasmid(pBV221+0.52 kb). 4:recombinant plasmid digested by HindⅢ

2　HIV-1 gp41 pPBV221重组质粒的构建
Fig.2　Construction of plasmid of HIV-1 gp41 gene and pBV221 vector

2.3　HB101受体菌内，温控诱导表达的蛋白经15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化分离(4)。考马斯亮蓝染色，可见19 300的蛋白，经分光光密度扫描仪测定显示特异性的表达量为8.6%。
2.4　重组表达gp41蛋白抗原性的检测结果　分别以阳性血清和1∶200、1∶20不同稀释度的阳性血清和1∶1 000的免疫酶，应用免疫血清法检测，3，3-二氨基联苯胺显色可见棕色的阳性条带，阴性对照则无其他的条带(5)，应用国家标准参比血清检测结果(6)可见8个阳性，8个阴性，与标准结果一致。

3　讨论

　　HIV感染人体后，出现p24、gp41、gp120等抗体，gp41抗体能持续稳定存在，p24随疾病的发生而下降。因此，HIV-1感染的检测主要是HIV-gp41抗体的检测。随着计算机在生物技术中的应用，对于抗原蛋白表面活性亲疏水性等理化性质及生物学功能作出综合分析判断，由此对抗原决定簇的定位作出理论预测。因此，本文只选用gp41的单一抗原决定簇基因片段进行重组表达，既可获得稳定的反应结构域，又保留了原有的生物学活性。重组的目的基因与载体之间有适宜的阅读框架和稳定的结构，因此，42℃温降。因此，HIV-1感染的检测主要是HIV-gp41抗体的检测。随着计算机在生物技术中的应用，对于抗原蛋白表面活性亲疏水性等理化性质及生物学功能作出综合分析判断，由此对抗原决定簇的定位作出理论预测。因此，本文只选用gp41的单一抗原决定簇基因片段进行重组表达，既可获得稳定的反应结构域，又保留了原有的生物学活性。重组的目的基因与载体之间有适宜的阅读框架和稳定的结构，因此，42℃温

3　经373A型仪器测定重组质粒核苷酸序列
Fig.3　Nucleotide sequence of recombinant plasmid

4　15% SDS-PAGE凝胶电泳分析重组表达蛋白
1：蛋白分量标记；2，3：宿主菌；5，6：重组表达样品；4，7：pBV221载体对照
Fig.4　15%SDS-PAGE analysis of expressed recombinant protein
1:Protein molecular weight marker. 2,3:Host bacteria. 5,6:Expressed protein sample. 4,7:Vector pBV221 control

5　重组表达蛋白抗原性测定HIV-1阳性血清
1∶20、1∶200稀释，1∶1 000免疫酶血清学检测(+为阳性结果，-为阴性对照)
Fig.5　Antigenicity detection of expressed protein HIV-1 positive serum dilution 1∶20、1∶200，1∶1 000 serum dilution for immunoenzyme assay (+:Positive results. -:Negative control)

6　国家标准参比血清检测HIV
1、2、5、7、8、10、11、12阳性； 3、7、9、12、20、24、27、28阴性
Fig.6　HIV detection with national standard reference serum
1，2，5，7，8，10，11，12: Positive. 3，7，9，12，20，24，27，28: Negative

本课题受国家“八五”(编号：85-916-03-02)“九五”攻关项目资助(编号：96-906-03-16)
作者单位：100050　北京　中国预防医学科学院病毒学研究所(滕智平　曾毅)；科技服务公司(李德贵　高连胜)

参考文献

［1］Joller-Jemelka HI, Joller PW, Muller F, et al. Anti-HIV IgM antibody analysis during early manifestations of HIV infection. AIDS, 1987, 1:45-47.
［2］Lange JMA, Paul DA, Huisman HG, et al. Persistent HIV antigenaemia and decline of HIV core antibodies associated with transition to AIDS. Br Med J, 1986, 293:1459-1462.
［3］Chargelegue D, Colvin BT, Otoole CM. A 7-year analysis of anti-Gag(p17 and p24) antibodies in HIV-1 seropositive patient with haemophilin: immunoglobulin G titre and activity are early predictors of clinical course. AIDS, 1993, 7(suppl 2):87-90.
［4］Vornhagen R, Hinderer W, Nebd-Schickel H, et al. Development of efficient HIV-specific test systems using recombinant viral antigens. Biotest Bulletin, 1990, 4:91-96.
［5］吴卫星，张维，马贤凯.在大肠杆菌中高效表达Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)Ⅰ型核心蛋白.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(11)：5-8.

(收稿：1999-01-28　　修回：1999-04-02)

人类免疫缺陷病毒型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达解析