抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备

1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

　　免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。

表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较

　　单克隆抗体的制备方法如下。

　　（一）动物的选择与免疫

　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

　　↓3周后

　　第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

　　↓2～3周

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

　　（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

（二）细胞融合

　　1．细胞融合前准备

　　（1）骨髓瘤细胞系的选择：

骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

　　（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2．细胞融合的步骤

　　（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

       ↓

　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

　　↓

　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓

　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）

　　↓

　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓

　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培养

　　（2）制备免疫脾细胞

　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

　　↓

　　无菌取脾脏，培养液洗 一次

　　↓

　　脾脏研碎，过不锈钢筛网

　　↓

　　离心，细胞用培养液洗2次

　　↓

　　计数

　　↓

　　取108脾淋巴细胞悬液备用

　　（3）制备骨髓瘤细胞

　　取对数生长骨髓瘤细胞离心

　　↓

　　用无血清培养液洗2次

　　↓

　　计数，取得×107细胞备用

　　（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

　　②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④离心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

　　⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

　　⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

　　（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测

　　1．HAT选择杂交瘤细胞 　　　脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

　　在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

　　2．抗体的检测　　 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

（四）杂交瘤的克隆化

　　杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

　　1．有限稀释法克隆

　　（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

　　2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

　　（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

　　（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

　　（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

　　（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

　　（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

　　（8）每个克隆应尽快冻存。

　　2．软琼脂培养法克隆

　　（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。

　　①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

　　②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

　　（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

　　（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏

　　1．杂交瘤细胞的冻存　　 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。

　　细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

　　2．细胞复苏方法 　将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

　　（六）单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

　　（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

　　（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。

　　（七）单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：

　　1．抗体特异性的鉴定 　　除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

　　2．McAb的Ig类与亚类的鉴定　　一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

　　3．McAb中和活性的鉴定 　　　用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4．McAb识别抗原表位的鉴定　　用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5．McAb亲合力的鉴定　 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

抗体的制备方法与原理