细菌培养及菌体收集
发布时间：2023-04-27 09:22:40
基因工程实验流程参考图：
挑取单菌落于5ml2216E培养基中，8℃培养，100rpm转速，振荡120h后，12000rpm离心15min。弃去上清液，加入10mlTE洗涤离心后，用10mlTE溶解菌体，混匀，–20℃保存备用。
细菌基因组DNA的提取
细菌基因组DNA的电泳细菌基因组DNA的16srRNA片段PCR扩增
PCR产物纯化与pMD18-T载体的连接
E.coli感受态制备
转化
阳性克隆筛选
碱变性法提取质粒DNA质粒DNA酶切验证确定菌株分类地位阳性克隆送样测序
序列比对以及系统发育树的建立
细菌培养及菌体收集
实验一：菌株基因组DNA的提取（CTAB方法）
CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解；
原理：采用溶菌酶破碎细菌细胞壁，加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞，可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。最后得到DNA。
操作流程：取3.5ml菌悬液，加入184μl10%SDS，混匀，溶菌酶浓度为2mg/ml，37℃温育1h。加入740μl5MNaCl，再加入512μlCTAB/NaCl，混匀，65℃温育10min。加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm离心5min，吸取上清液。上清液中加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，混匀，10000rpm离心5min，吸取上清液。加入0.6倍异丙醇，混匀，10000rpm离心5min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。用1mlTE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃溶解过夜，–20℃保存。
实验二：DNA电泳鉴定1．目的
学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理
DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材
电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4．试剂
细菌基因组DNA，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA/HindIII+EcoRI）。5．实验准备
配制 