微量肉汤稀释法测MIC

一、试验原理目的

细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。

二、试验器材、化学试剂及菌种

96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌

三、试验准备

1、培养基的配置

MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。

2、工器具的灭菌

将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。

2、抑菌剂的配置

抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液，NaOH溶液，DMSO溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作为抗菌药原液。

3.、菌悬液的配置

从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液），再吸取0.5ml加入到4.5mlMH培养基中，用枪头吹匀待用。

四、试验步骤

1.在96孔板每个孔加入MH肉汤培养基100μl 。

2.在A/B/C三排的第一孔加配好的药液100 μl，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12列吸出100ul扔掉。

3.再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl,重复做三次（A/B/C三排样品）。

4.在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在H排上做一排阳性对照（加菌液不加药液）。

5.将96孔板放入37℃恒温培养箱16～20小时后，观察结果。

五、结果观察记录：

1、若有菌生长孔板底部会有白色沉淀。

2、MIC值的判定：96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。

3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果。

4、记录结果并将每种药物的MIC值。

六、注意事项：

无菌操作

1、除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理。

2、 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；不能拿酒精面球球擦挡板。

3、 操作前洗手，用酒精棉球擦手。

4、每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不能在究竟灯上烤。

5、 操作过程中加液尽可能不将96孔板盖完全打开。

MIC的测定（微量二倍稀释法）