BPRP在神经系统中作用的研究思路

2004.3.6

一、细胞水平实验

（一）PC12和SH-SY5Y细胞培养

　 PC12和SH-SY5Y细胞复苏时迅速从液氮中取出，置于37℃水浴中来回晃动使其尽快融化，置于含完全培养液的离心管中1000rpm离心5-10分钟，弃上清，沉淀用完全培养液悬浮并成混匀液，移于培养瓶(密度约5×105个/ml)，置37℃、5% CO2培养箱内培养，2天换液一次，约7天传代一次。完全培养液为高糖DMEM13.4 g，配成1000ml，内含NaHCO3 3.7 g，青霉素G 钠100 U/ml, 链霉素100 g/L，pH 7.2-7.4 ,加入10% 56℃灭活胎牛血清。待长满培养瓶单层后,用吸管轻轻吹打使其脱落并成混匀液,传代或接种置培养箱内继续培养进行以下实验。或冻存于9份完全培养液+1份DMSO（二甲基亚砜）中，4℃放置0.5小时，-20℃放置2小时，液氮口放置过夜，次日投入-196℃液氮中。（冻存密度>5×106个/ml）

（二）实验研究

1.细胞增殖的研究

1.1增殖研究

1.1.1细胞培养于96孔培养板中，接种密度为5×103-2×104个/ml，每孔100ul，连续6天用MTT法检测细胞的增殖情况，终止培养前4小时每孔加入5mg/ml的MTT溶液15ul(终浓度为0.5-1mg/ml)，置孵箱终继续培养4小时，弃去培养液，在每孔终加入溶解液DMSO或无水乙醇100ul，置37℃振荡孵箱中充分溶解产物，约10分钟，在酶标仪上波长560nm检测每孔的光密度（OD）值。每次实验均应设与实验孔平行的空白对照，即除了不含细胞外其他条件相同的对照孔，最后比色时以对照孔调零。（给药前或给药后均可采用此方法研究）

1.2.2细胞接种于24孔培养板中，密度为1×105个/ml，每组设两个组，连续6天计数，采用台盼兰染色法：称0.4g台盼兰，加少量蒸馏水研磨，定量至100ml，0.22um滤膜过滤，4℃保存。加0.9ml细胞悬液和0.1％台盼兰于试管中，充分混匀后静置1-2min,不超过5min，计数后取平均值，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标作图。（给药前采用此方法研究）

2凋亡研究

2.1活化的Caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸酶）荧光染色法：细胞凋亡最早的特征性变化之一是Caspase酶的活化，凋亡细胞中32kD的Caspase-3原酶裂解为一个17-21kD的亚单位和一个12kD的亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，因此可采用荧光染料标记抗活化的Caspase-3抗体来检测凋亡细胞并在流式细胞仪上进行样本分析。（Caspase-3抑制剂为AC-DEVD-CHO）。具体方法和步骤见《神经细胞培养理论和实践》211页，以及参考文献抑制剂Ac-DEVD-CHO对氧化损伤诱导晶状体上皮细胞凋亡的防护作用>

2.2细胞凋亡的琼脂糖凝胶电泳检测方法：细胞凋亡时最主要的生化特征时依赖Ca2+ 、Mg2+的内源性核酸酶被激活,将染色质DNA在核小体单位连接处水解而形成180-200bp或其整数倍的寡核苷酸片断,采用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭可观察到DNA梯形电泳图谱,称为DNA ladder。具体方法和步骤见《神经细胞培养理论和实践》204-205页。

3.对PC12和SH-SY5Y两种神经细胞系进行细胞免疫组化研究，目的有二：一是观察BPRP的有无，二是定位BPRP在细胞中的位置。

3.1免疫酶细胞染色

1）在6孔培养板（Corning）接种PC12和SH-SY5Y两种神经细胞系，各3孔，每孔2.5ml，密度均为2х105个/ml，接种后24h开始实验。

2）翻板法去除培养液，加入预热至35℃的0.1M PBS洗2次。

3）加入4%多聚甲醛溶液，固定20min。

4）加入0.1M PBS， 5minх3次。

5）加入3% H2O2（甲醇溶解），室温避光孵育30min，

6）PBS洗5minх3次。

7）滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育40min。以去除非特异性显色。

8）滴加用抗体稀释液1：300稀释的抗BPRP多克隆抗体，4℃过夜。对照组直接加入0.1M PBS代替I抗。

9）4℃过夜后取出，室温平衡1h。

10）0.1M PBS洗5minх3次。

11）滴加生物素化羊抗兔IgG，室温孵育40min。

12）0.1M PBS洗5minх3次。

13）滴加辣根过氧化物酶标记的链亲和素，室温孵育40min。

14）0.1M PBS洗5minх3次。

15）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度，适时终止。

16）自来水洗10分钟。

17）苏木精复染细胞核15分钟，蒸馏水洗。

18）用甘油缓冲液封片，照相。

3.2免疫荧光细胞染色

1）在3.5mm培养皿接种PC12和SH-SY5Y两种神经细胞系，各2孔，每孔1ml，密度均为2х105个/ml，接种后24h开始实验。

2）翻板法去除培养液，加入预热至35℃的0.1M PBS洗2次。

3）加入4%多聚甲醛溶液，固定20min。

4）0.1M PBS， 5minх3次。

5）0.2%Triton X-100增加细胞的通透性，10分钟。

6）0.1M PBS， 5minх3次。

7）滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育1小时，

8）0.1M PBS， 5minх3次。

9）用抗体稀释液1：300稀释抗BPRP多克隆抗体，孵育2小时或过夜，对照组直接加入抗体稀释液代替1抗。

10）PBS洗5minх3次。

11）滴加用FITC标记的羊抗兔2抗（1：10稀释），避光孵育1小时。

12）0.1M PBS洗5minх3次。

13）加0.625ug/ml的PI（碘化丙啶），作用25min

14）用甘油缓冲液封片，荧光下照相。

4.冻融法提取PC12和SH-SY5Y中的蛋白质，Brandford法测定蛋白含量， 采用Western Blot进一步观察BPRP的有无和表达的水平。

4.1冻融法提取蛋白质：各收集2х107个个细胞，1000rpm离心10Min，弃上清，加入预冷的PBS，悬浮细胞，1000rpm离心10Min，如此2次，加入200ul蛋白抽提缓冲液，投入液氮中2min，放入37℃水浴中来回晃动使其溶解，2Min，如此三次，12000rpm离心10min,取上清，-70℃存放。

4.2 Brandford法测定蛋白含量：所需材料为0.5mg/ml BSA（牛血清白蛋白），0.15mol/L NaCL, 考马斯亮蓝G-250染料溶液，比色杯。步骤为取11支试管编号，依次分别加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50ml 标准BSA溶液，用水补足至0.50ml ，各加3ml染色液，摇匀，放置15分钟，然后于595nm波长处比色，以“0”号管调零。另取20ul未知浓度的蛋白质溶液，稀释至0.5ml，同上测定。以A595nm为Y轴，BSA浓度为X轴，画出标准曲线并算出回归方程。

4.3 Western blotting：

4.3.1配胶

4.3.2灌胶：用巴斯德管加入7.5.%分离胶，然后压一薄层水，待凝固后，可见水胶界限分明，先倒过来弃水层，再用滤纸吸干，加入4%的浓缩胶，比短玻璃稍高，立即插入梳子，待凝固后若有胶回索现象，再补加一些。灌好的胶可放在装有少量蒸馏水或电泳缓冲液中的保鲜袋中4℃保存。

4.3.3上样：搭好装置，样品与5хsample buffer混匀，100℃水浴5-15min（5min），每孔所上样品（即粗总蛋白质）50ug。

4.3.4电泳;150V,约50-80min。

4.3.5其中一块胶用考马斯亮蓝染色，染色前用固定液固定20min，放于摇床上。倒去固定液，加入染色液，放于摇床上染色约30Min，用清水洗去凝胶上残留的染色液，倒入托色液，置于摇床上脱色约4小时，其间换液2-3次。另一块电泳后的胶留做转膜。

4.3.6把硝酸纤维素膜在电转移缓冲液中浸泡15-20min(如用PVDF膜需再甲醇中浸泡5min)。

4.3.7聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：

A 打开转移盒，并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后，把其放在转移盒壁上(黑面)，海面上再放置一张浸泡过的whatman 3mm滤纸。

B小心把凝胶放置于滤纸上，避免产生气泡。

C以转移缓冲液润湿胶面，小心把硝酸纤维素膜放于胶面上，避免产生气泡。

D在硝酸纤维素膜上放置一张浸湿的whatman 3mm滤纸，用一干净的小试管滚过膜“三明治”以消除所有的气泡。

E 把另一块海绵用电转移缓冲液浸透后，放在凝胶膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽（转移盒黑面贴转移槽黑面）。

F在转移槽中注满电转移缓冲液。

4.3.8电转移：恒流100mA，4小时。

4.3.9膜的封闭：拆卸转移装置，把滤纸揭下，用镊子把膜放入平皿中，加入5%TBS-脱脂牛奶封闭，液面没过膜，置于摇床上轻徭30-60min（60min）。

4.3.10加入一抗：用2.5%TBS-脱脂牛奶1：500稀释抗BPRP多克隆抗体，清除气泡，封闭塑料袋，室温摇床孵育过夜。

4.3.11 0.05 TBS-T（pH7.5）洗膜5min/次х3次。

4.3.12 加入二抗：用用2.5%TBS-脱脂牛奶1：3000稀释二抗，清除气泡，封闭塑料袋，室温摇床孵育1-2h（2h）。

4.3.13 0.05 TBS-T（pH7.5）洗膜5min/次х3次。

4.3.14 碱性磷酸酶显色剂显色：加入碱性磷酸酶显色剂，放于暗处，不时观察显色程度，条带一出现即用蒸馏水冲洗以终止显色反应。

4.3.15用吸水纸吸干膜上的水分，避光干燥保存。

5.采用放免法检查胰岛素是否存在于PC12或SH-SY5Y中。购买中国科学院原子能研究所研制的I-胰岛素放射免疫试剂盒，按说明书操作。此方法不仅可以定性还可定量。

6.利用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、氰化钠(NaCN)、谷氨酸、硝普钠等药物和无血清培养造成细胞缺血缺氧状态，或利用高纯氮气和无糖Hanks液培养造成缺血缺氧状态，采用Western Blot检查BPRP表达量的变化。这一步工作同时也是对以前工作的验证，因为BPRP是我们在对整体动物脑缺血缺氧（MCAO）研究时发现并分离的。

　 6.1 Na2S2O4 致PC12 细胞缺氧损伤模型　取PC12 细胞铺满单层的96 孔培养板,弃原液,用PBS液清洗两次,加入200μl无血清DMEM，然后加入氟西丁作用30 min 后, 加入1 mmol/L Na2S2O4 作用1 h ,弃培养液,用PBS清洗两次,加入200μl 无血清DMEM ,置37 ℃、5 %CO2 培养箱内继续培养进行以下实验。

6.2 NaCN加缺糖致PC12 细胞拟缺血损伤模型

取PC12 细胞铺满单层的96 孔培养板,弃原液,用PBS 液清洗两次,准确加入200μl 无糖Earle’s 液(g/L: NaCl 6. 68 , KCl 0. 04 , CaCl2 0. 2 , MgSO4·7H2O 0. 2 , NaH2PO4·2H2O 0.4 , NaHCO3 2.2 ,甘露醇1.0 , Hepes 4. 8 , 酚红0.02 , pH 7.2-7.4) ,作用20 min 后, 加入氟西丁作用30 min ,加入20 mmol/L NaCN 作用5 min ,弃培养液,用PBS 清洗两次,加入200μl无血清DMEM ,置37 ℃、5%CO2 培养箱内继续培养进行以下实验。

6.3 测定指标

6.3.1 MTT 法测定活细胞数：作用20 h 后加入5mg/L的MTT 反应4 h ,吸去上清液(注意避免吸走甲瓒结晶) ,每孔加入100μl DMSO ,待孔内颗粒完全溶解后,调零,测定560 nm 处的OD 。

6.3.2 Western blotting:同上

6.3.3 LDH 活性测定　损伤作用发生后的24 h ,收集培养液0. 5 ml ,用LDH 试剂盒测定其中LDH 活性。

7.给予细胞链脲霉素（STZ），造成AD细胞模型，并给予氟西丁，检查BPRP表达的量与胰岛素水平之间的关系。

8.给予细胞氟西汀（百忧解），检查BPRP表达的量与胰岛素水平之间的关系。

9.磺酰脲类降糖药（如优降糖）在刺激胰岛素分泌的情况下观察260 kDa

蛋白表达的变化和胰岛素分泌水平的时效关系，并用磺酰脲类降糖药的拮抗剂-ATP敏感的钾通道激动剂（如二氮嗪）作进一步的机制分析。

10.造成细胞缺血氧状态，同时给予calpain（钙激活蛋白酶）或caspase-3等蛋白酶的抑制剂（可抑制脑缺血相关蛋白的降解），，观察细胞中BPRP表达量的变化。

11.给予胰岛素，检查Aβ及BPRP含量的变化，

12.给予不同浓度的葡萄糖，刺激胰岛素分泌，观察BPRP蛋白和胰岛素分泌水平的时效关系。

二、BPRP在海马神经元中功能的研究

1溶液的配制：

1.1配制磷酸缓冲液：取KH2PO4 0.1g,Na2HPO4.12H2O 1.7g,KCl 0.1g,NaCl 4.0g,用双蒸水溶解并定容至500ml，调pH值为7.2，用0.2um的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.2配制胰蛋白酶储备液：用磷酸缓冲液配制浓度为0.25的胰蛋白酶储备液，冻存备用。

1.3配制多聚赖氨酸溶液：取多聚赖氨酸25mg,用双蒸水溶解并稀释至330ml。浓度为0.075mg/ml，用0.2um的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.4配制谷氨酰胺储备液：取谷氨酰胺2.92g，用磷酸缓冲液溶解并稀释至25ml，浓度为40mmmol/ml。

1.5配制解剖液：KH2PO4 0.03g，Na2HPO4.7H2O 0.18g，KCl 0.4g，NaCl 8.0g,葡萄糖1.8g，于9.0mmol/L HEPES的缓冲液溶解，并加到1000ml，pH7.3，320-33mOsm。用0.2um的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.6配制DMEM 培养基：取高糖DMEM 13.4g/包 一包，加碳酸氢钠3.7g，用三蒸水稀释到1000ml，调pH 7.1，用0.45和0.22的微孔滤膜过滤，此时pH升高约0.2至7.3左右。分装，-20℃保存。

1.7配制阿糖胞苷储备液：取5mg阿糖胞苷，用25ml磷酸缓冲液溶解成0.2mg/ml，用0.2um的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.8包被培养皿：使用前2天，在无菌条件下取35mm塑料培养皿。加多聚赖氨酸1ml/皿，放置过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，自然干燥备用。

1.9种植液和饲养液：

用于接种海马神经元的培养基（种植液）成分为：DMEM培养基75%，马血清10%，胎牛血清10%，谷氨酰胺储备液5%。

用于饲养海马神经元的培养基（饲养液）成分为：DMEM培养基82%，胎牛血清10%，N-2 1%，B-27 2%，谷氨酰胺储备液5%。

2.海马神经元的分散和培养：

取出生12小时以内的乳鼠，冰冻麻醉后用75%乙醇浸泡消毒。无菌条件下取脑，解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中。用手术刀片将海马切成1-2mm3的组织块，用0.25%的胰蛋白酶的磷酸缓冲液在37℃下消化20-25min后，加入等量血清，再将组织块移入适量种植液中，用抛光过的适当口径（尖端直径1-2mm）的滴管吹打，1000rpm离心一次，再加入适量种植液吹打，使之均匀分散，使成细胞悬液，取少量悬液以台盼蓝液观察存活率（一般〉90%）并计数细胞。将细胞按2-3×105个/ml的密度接种在多聚赖氨酸包被的35mm的培养皿中，置37℃、5% CO2培养箱内培养，24小时后更换培养基，将种植液换成饲养液。以后每周半量换液两次。为抑制非神经元的过度增殖，在培养的第四天向培养基中加入适量的阿糖胞苷，每皿中加阿糖胞苷储备液30-50ul，终浓度为3-5ug/ml。

3.实验研究：

三、整体水平的研究：选用SD大鼠，

四、写一篇关于AKAP的综述

caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO(美国PharMingen公司);兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体(可识别相对分子质量32 000的非活性前体及20 000活性亚单位，美国Santa Cruz公司);AnnexinV -PI细胞凋亡检测试剂盒(美国Genzyme公司)

caspase-3抑制剂有Ac-DEVD-CHO（特异性），z-VAD-fmk(广谱)，Ac-IETD-CHO，z-VAD(oMe)-CH2F， Ac-YVAD-CHO，

BPRP研究思路和方法（有有关细胞凋亡与细胞增殖的内容）