A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度

原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。

优点：1. 快速；2. 对蛋白质无破坏性。 缺点：1. 不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。 另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜），另外核酸可引起强烈干扰。 灵敏度：0.2 mg/ml ~ 2 mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1 ml。

注意事项：1. 实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml。2. 如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。

测量方法和计算公式：对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，一般来说，1 A280 Unit ≈ 1mg/ml (说明：此处默认蛋白的A280消光系数为1；对于浓度位于0.02 mg/ml ~ 3 mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1 mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度≈ A205/31）；对于存在核酸污染（A280/A260<0.6）蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，（0.5 ~ 1.0）按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）= [1.55 × A280] － [0.76 × A260]/蛋白浓度（mg/ml）= A205 ÷ (27＋A280/A205)

测量纯化出来的已知蛋白的浓度（或成分不明的蛋白混合液）

步骤：1、到ProtParam tool网站在线预测该蛋白质的消光系数；2、用蛋白buffer作对照调零后，根据经验，将蛋白溶液稀释至合适的浓度，使其280 nm处光吸收值位于0.5 ~ 1.0区间之内（通常试一次就能找到恰当的稀释比例）；3、做三次平行的测量，记录280 nm光吸收值。（三次平行指独立稀释三次，测量三次）4、计算：A280 / 消光系数；【对于蛋白混合液，默认消光系数为1.0】三次平行的数据分别计算得到结果，然后求其平均值。

A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度