一、【目的要求】

1． 学习芽孢染色法，了解芽孢的形态特征；

2． 观察酵母菌形态及出芽方式，区分酵母死活细胞；

3． 学习酵母菌子囊孢子的观察方法。

二、【实验原理】

1. 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦被着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进如芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。

2. 酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，麦氏培养基 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。

三、【实验器材】

1． 菌种：

枯草芽孢杆菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，梭形芽胞杆菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，酿酒酵母菌7d麦氏培养基斜面培养物。

2． 溶液和试剂：

5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液、95%乙醇、0.01％美兰水溶液。

3． 仪器和其他用品：

酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子等。

四、【实验内容】

1.细菌芽孢染色:

①涂片、加热干燥及固定；

②向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用木夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸；

③待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；

④用0.5%番红水溶液复染2min；

⑤用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；

⑥将载玻片晾干后油镜镜检。

2.酵母菌观察:

（1）美兰染液水浸片法：

①在载玻片中央加一滴美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌液，混合均匀；

②用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，避免产生气泡；

③将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞；

④染色30min后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。

（2）子囊孢子的观察：

①取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片上按常规涂片、干燥固定；

②滴加孔雀绿染液染色 1min~1.5min，水洗；

③用 95% 的乙醇脱色 30s，水洗；

④用番红复染 30s~1min，水洗，干燥；

⑤干后用油镜观察子囊孢子的形态。

五、【实验结果】

1.细菌芽胞染色

①形态记录表

②枯草芽孢杆菌和梭形芽胞杆菌芽孢形态对比：

（A）枯草芽孢杆菌芽孢 （B）梭形芽胞杆菌芽孢

2.酵母菌观察：

（1）美兰浸片观察：

1 酵母菌出芽生殖图

酵母菌出芽生殖的过程：菌体的一端冒出一个小芽，渐渐变大，最终脱离母体。

②染色3min和染色30min后酵母菌死活细菌对比：

(A)染色3min (B)染色30min

结果分析：

1.经过染色后，显微镜下菌体有蓝色和无色两种，其中蓝色是死菌，无色为活菌。

2.染色3min后酵母菌存活比例为1/7；染色30min后酵母菌存活比例明显下降，仅为1/36。由此可见，染色时间越长，酵母菌存活比例越低。

（2）酵母菌子囊孢子观察：

结果分析：

在酵母菌子囊孢子观察中，在视野中几乎观察不到绿色的芽孢，经过三次制片后，只能观察到几个子囊（如上图）。分析其原因，可能是菌种培养时间不够，故菌种产孢子效果不好。

六、【思考题】

1． 为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？

答：加热促进芽胞着色。芽胞壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色，芽胞呈无色透明状。

2．若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。

答：①由于芽孢的壁厚，耐压力比细胞体强。因此有可能是由于在图片是用力过大，将细胞体的细胞壁压碎，从而使芽孢脱落出来的缘故。②也有可能是由于菌体培养时间过久，芽胞正处于复苏阶段，所以大多芽孢都从饱囊中游离出来。

3. 用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？

答：若玻片不冷却就用水冲洗，会使玻片因突然遇冷而炸裂。

4. 根据你的观察结果，美兰染液浓度及作用时间与酿酒酵母死、活细胞比例变化是否有关系？是分析原因。

答：有关系。

原因：①染色剂作用时间较慢，随时间的增加被染的死细胞数目增多；

②染色剂导致菌体细胞脱水，时间越长，酵母菌死亡数目越多；

③随时间增加，更多代谢缓慢的老细胞被染色，观察时被当做死细胞。

芽孢染色及酵母菌观察