冰冻切片实验技术

发布时间：2019-11-12

实验技术：组织切片的制备

点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润
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组织切片的制备
二）切片方法-细节注意 1 切片方法的选择
光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。 1.1 冰冻切片
是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，
进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】
组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】
苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。
【材料】 1.试剂和溶液

（1）2-甲基丁醇(异戊醇 （2）干冰
（3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA （4）冰冻或石蜡组织块 （5）酸性Harris 苏木素染料 （6）1％酸性酒精 70％酒精 99 ml 浓盐酸 1 ml （7）醇溶性伊红染料 （8）酒精 （9）二甲苯 （10）树脂封片液 2.设备 （1）塑料模具 （2）长镊子
（3）Superfrost Plus玻片(Fisher Scientific （4）盖玻片
（5）刀片(一次性或非 一次性；
（6）冰冻或石蜡切片机(Leica , Micorm 或其它

【方法】
方法1、冰冻切片的制备 一、准备冰冻组织
1. 用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇(异戊醇，然后不时放入小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。
2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。
3. 收集组织标本。快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。
4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌满模具，直至标本完全被其覆盖。组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。酌情调整组织标本的位置。用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇(异戊醇溶液中。为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。
（1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。不要用溶液清洗标本。
（2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。
5. 将冻好的组织标本保存在-80ºC 冰箱以待使用。 二、制作冰冻切片
1. 切片前先将冰冻组织标本从-80ºC冰箱里取出，放在冰冻切片机(-20ºC 内复温。

2. 用O.C.T.将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上。调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片。直至切到预想的部位后，开始收集切片。根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度。3-6 µm是常用的切片厚度，也可以是25-50 µm厚。
3.切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定。如果选用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在经过20 分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者将其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。
4. 余下的冰冻组织块，可用O.C.T.覆盖其暴露面，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。
方法2、石蜡切片的制备
1．收集组织标本并将其固定。10％福尔马林缓冲液是最常用固定液，也可根据实验的需要选用其它固定液。根据标本的大小，将其在室温下固定8-24小时，或更长。标本的厚度以不超过3 mm 最佳。完成固定后，标本即可进行下一步的处理。
2．制作石蜡组织块需要专用的设备，以及复杂的组织处理过程。通常由组织学或病理学实验室完成。
3．石蜡切片。准备好盛有40ºC蒸馏水的水浴箱，把包有组织的石蜡块固定在石蜡切片机上，根据需要切成一定的厚度(常用4-6 μm，将切片浮在水浴箱的水面上，再转到Superfrost Plus片子上。切片在室温下自然风干过夜，贮存待用。

冰冻切片
(一冷冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时*代的变迁，科技的发展，许多年前被
认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 (二冷冻切片的目的
（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
（2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
（3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。
（4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
（5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
（6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。
（7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 （8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 （三）冷冻切片的制作方法 （1）低温恒冷箱冷冻切片制作法
1．Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。
冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。 3．冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 ③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也
是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。 4．冰冻切片的快速染色法
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。 方法：

1. 切片固定30秒－1分钟。 2. 水洗。

3. 染苏木素3－5分钟。


4. 分化。

5. 于碱水中返蓝20秒。 6. 伊红染色10－20秒。 7. 脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。 脑片固定与冰切 方法一
戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠(50mg/kg,经升主动脉依次灌注生理盐水80ml(室温，4%多聚甲醛(0.2mol/L PB配制，pH7.4，4℃400～500ml后，取脑，置入同种固定液后固定4h，然后浸入含30%蔗糖的0.01mol/L PBS溶液中，待脑组织下沉后，行冠状冰冻切片(厚30μm。每5张切片取1张，置入抗IL-6R或gp130的兔血清中，抗体工作浓度均为1∶500，室温(约30℃孵育15～20h，然后行ABC法免疫组织化学染色，用葡萄糖氧化酶-硫酸镍铵-DAB增强法呈色。依次将脑切片贴于涂布有明胶铬明矾的载玻片上，脱水、透明、中性树胶封片，镜检观察。 方法二
动物取材实验大鼠用１０％水合氯醛腹腔注射麻醉，经左心室插管至主动脉，灌注生理盐水100 ml待肝脏变白后，继续灌注４%多聚甲醛（含0.1% DEPC，抑制ｍＲＮＡ的降解）100ml至大鼠僵硬，开颅取脑组织，固定于含４％多聚甲醛的30%蔗糖中静置７２ｈ，待脑组织下沉后，进行冰冻切片，厚度为２０μｍ。连续切片，每２０张取一张作原位杂交。
取部分切片做ＨＥ染色。实验步骤严格按照试剂盒所附步骤进行：① ３０％过氧化氢、纯甲醇封闭组织抗原。② 暴露ｍＲＮＡ核酸片段，１％多聚甲醛后固定。③ 预杂交，37℃恒温箱４ｈ。④ 滴加杂交液，覆盖原位杂交专用盖玻片，３７℃恒温箱过夜。⑤ 杂交后充分洗涤。⑥ 滴加封闭液。⑦ 滴加生物素化鼠抗地高辛。⑧滴加ＳＡＢＣ。⑨ 滴加生物素化过氧化物酶。⑩ ＤＡＢ显色，显微镜下观察显色情况，显色后充分水洗、苏木素复染、酒精脱水、二甲苯透明、
中性树胶封片. 方法三
动物麻醉后，用4%多聚甲醛加0.3%饱和苦味酸混合液(pH7.2～7.4行主动脉灌注，取脑、小肠和膀胱置于相同固定液中8～12h(4℃，再用含20%蔗糖上述固定液浸泡至组织块下沉后冰冻切片(厚30μm。 方法四
大鼠麻醉方法同前。首先快速灌注生理
盐水10-25ml，继用0.375%硫化钠1000g/ml 灌注，接着予4%多聚甲醛1500ml/kg 进行内固定，取脑，后固定18-20hr后，将脑转移至30%蔗糖0.1 mM 磷酸缓冲液中72hr。待脑组织下沉后，液氮快速冷冻，冰冻冠状切片. 方法五
断头前, 经升主动脉先灌注生理盐水, 再灌注含4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸的磷酸缓冲液(PB,pH 7.4, 0.1 mol/L。取脑固定2 h后, 浸入20%蔗糖磷酸缓冲液中至组织块下沉, －70℃低温冰箱保存待原位杂交。 方法六
乙醚麻醉后经左心室4%多聚甲醛溶液灌流,固定,取脑。经4%多聚甲醛溶液后固定24h后,于20%DEPC处理蔗糖溶液内置换过夜。OCT(SakuraFinetechnicalCo.,Tokyo包埋,冰冻冠装切片,切片厚度18μm。 方法七
假手术组于手术后即刻断头取脑，各观察组及对照组于手术后6、12、24、48、72、96h断头取脑，OCT包埋后-70℃保存，冰冻切片机切取10 μm厚冠状切片，取海马和皮层区进行原位杂交检测。


原位杂交组织制备
1．切取的组织PBS洗涤；
2．4%多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4在4℃固定组织1-3hrs。避免固定过夜，如果固定过长可能引起组织附着在载玻片上的问题; 3．组织浸入无菌15%蔗糖/1×PBS中3hrs。到4℃过夜;组织块沉底. 4．用OCT包埋。
5．组织块冷冻在液氮中，把组织包埋块的1/3（大约）放入液氮中直到包埋剂OCT的中心完全冻结，包埋块上出现干冰。
6．组织放入密闭容器中或用锡箔包住贮存于—70℃。


如果不能用多聚甲醛/蔗糖法，还可以采用冷冻新鲜组织用于原位杂交。组织也要用PBS洗涤，OCT冷冻包埋组织块。上述方法虽然不够理想但没有模型也能速冻组织。固定剂蔗糖和OCT步骤的应用主要是为了改善组织形态。上述固定时间不能完全彻底固定大块组织，然而在原位杂交步骤开始时有附加固定步骤确保杂交前组织充分固定。
此方法用于大（1 cm3）和小（到1 mm3）组织样品是成功的。

原位杂交标本的处理
注意：RNA酶存在时很不稳定。RNA酶是无所不在的，皮肤上，物体的表面。要是用干净的没有处及的玻璃器皿，尤其是试剂保存瓶，DPC-处理水溶液和70%酒精可灭活此酶。

4%多聚甲醛
混合于2000ml烧瓶中：
200ml 0.5M 磷酸钠（NaPO4）pH7.4 800ml DEPC-H2O 将液体加热到70℃加入40g多聚甲醛（EM grade, Polysciences, Cat No. 0380）加热4-5min液体会变清亮，过滤后及时装入1000ml瓶中，迅速用冰冷却液体防止多聚甲醛分解。4℃可保存两周。

15%蔗糖PBS配制

500ml 灭菌PBS 75g无RN酶（RNase free）蔗糖
试剂混合后用一次性小型Nalgen 过滤器（0.45 um）除菌。4℃保存。

组织里面有水就会有冰晶。不速冻，内外的结构就不均一，容易产生形变。 是的，具体操作看说明。张敬敬知道的。像煎鱼，泡沫盒底放点液氮，包埋盒的1/3深，用镊子平平放下去，从下往上冻牢固，有的说10分钟，反正要冻透。 能做到你上次作的那样，片子不擦破，就可以了。小泡泡可以拍得时候放大倍数小一点。

我昨天收集了很多做冰冻切片的方法，做了比较。明天OCT包埋和液氮速冻的方法注意看一下。 蔗糖没有泡到沉底，即组织内所有的水分都被蔗糖溶液替代，是产生空洞的原因之一；还一个就是没有液氮冻，液氮冻过，组织内部的结果就致密均一了。


(二 冰冻切片

¨ 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。 ¨ 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。 – 缩短了制片时间 – 抗原性不受损失

• 对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。 ¨ 组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。 1、冰冻组织块的常用方法 ¨ 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196℃中10～20sec；

¨ 干冰中加入丙酮(或异戊烷，液体立即气化起泡，温度降至一70℃ ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好； – 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。

– 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 ℃冰箱。 2、切片 ¨ 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。 ¨ 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂； ¨ 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 ℃ 。切片厚度一般为4～8mm。 3、切片后处理 ¨ 切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4℃丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。 ¨ 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。 (三 组织印片 ¨ 将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。 (四 细胞培养片(细胞爬片 ¨ 贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20°C固定10～20min，再进行免疫染色。 – 盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。 – 为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。


冰冻切片实验技术

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