PCR-荧光法与PCR-膜杂交法在检测HPV-DNA中的比较分析

赵一琳，崔映红，黄少芝

【摘 要】目的 比较并分析PCR-荧光法与PCR-膜杂交法在临床感染人乳头瘤病毒(HPV)中的检测结果，探讨其不同的应用价值。方法 收集204例标本，分别采用PCR-荧光法与PCR-膜杂交法检测HPV-DNA，以细胞组织学诊断为标准分为未见上皮内病变或恶性病变(NILM)组(152例)、意义不明的非典型鳞状上皮细胞增生(ASC-H)组(27例)、鳞状上皮细胞低度病变(LSIL)组(21例)、鳞状上皮细胞高度病变(HSIL)组(2例)和宫颈鳞癌(SCC)组(2例)。比较各组患者HPV-DNA阳性率，通过统计学方法比较2种方法的差异性。结果 204例标本中PCR-荧光法检测阳性67例，阴性137例，阳性率为32.8%。PCR-膜杂交法检测阳性94例，阴性110例，阳性率为46.1%。细胞学诊断有异常细胞52例(25.5%)。NILM组患者2种方法检测HPV阳性率分别为12.5%、28.3%，差异有统计学意义(χ2=11.670，P=0001)；细胞异常组患者2种方法检测HPV阳性率分别为92.3%、98.1%，差异无统计学意义(χ2=1.891，P=0.363)；细胞异常组患者2种方法检测HPV阳性率与NILM组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR核酸扩增检测HPV-DNA具有很高的特异性与灵敏度。在临床筛查诊疗中PCR-荧光法具有更高的应用价值，而在非高危性HPV检测领域和科研领域PCR-膜杂交法更具优势。HPV-DNA检测结合细胞组织病理学检查可提高HPV感染诊断的准确性与临床指导意义。

【期刊名称】国际检验医学杂志

【年(卷),期】2016(000)002

【总页数】3

【关键词】乳头状瘤病毒科; 聚合酶链反应; 荧光; 膜杂交法

·论 著·

人乳头瘤病毒(HPV)是妇女生殖道感染的常见病原体，是宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的主要病因。有研究表明，99%宫颈癌患者存在HPV感染，在美国至少有80%妇女到50岁时有过一次以上HPV感染史[1]。由于HPV感染与宫颈癌的高度相关性，而HPV阴性者几乎很少发生宫颈癌；且HPV感染与宫颈癌的发生具有时序关系，不同亚型HPV在致病性方面均存在差异[2]，所以在临床对宫颈癌的筛查中进行HPV及其分型检测是一项极其重要的检查手段。HPV分型检测对临床CIN和宫颈癌筛查和评估、治疗后的随访、病程进展监测及人群流行病学状态和病毒疫苗的研制均具有重要意义。目前国内临床进行HPV DNA检测的主要方法为实时荧光PCR与杂交捕获法[3]。本研究采用PCR-荧光法与PCR-膜杂交法同时检测临床标本中的HPV并以细胞学诊断作为依据对检测结果进行分析和评估，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月至2014年12月江苏省常熟市第二人民医院妇科门诊患者204例作为研究对象，年龄20～60岁，平均(36.5±7.0)岁，均存在性生活史并自愿接受细胞学和HPV病毒学检测。所有检测标本均为从受检者宫颈口鳞、柱状上皮交界处采集，使用一次性棉拭子。采样前拭去宫颈口过多分泌物，将宫颈刷伸入宫颈外口，轻压旋转取得脱落细胞。迅速将宫颈刷浸入盛有1 mL无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗，贴壁挤干后即刻送检。细胞学检查标本采用专用脱落细胞采集器采集，即时送检。

1.2 方法

1.2.1 PCR-荧光法 13 000 r/min离心5 min，取沉淀，采用港龙生物技术有限公司提供的试剂盒提取标本DNA，取2 μL待测DNA加入试剂盒提供的反应管。管内含有根据13种高危型HPV的L1基因靶序列设计一组高度特异的引物和探针，在同一PCR反应中检测宫颈脱落细胞中的13种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)DNA。反应参数为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40个循环(95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min)。PCR-荧光法是在PCR过程中使用荧光PCR检测仪同时记录荧光标记探针在分子杂交时每次PCR循环释放出的荧光能量变化，直接反映出PCR扩增产物量的变化。采用美国ABI 7500自动记录荧光值变化并转换成DNA模板量，用以判断检测结果。设立HPV阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照，以保证质量受到控制。

1.2.2 PCR-膜杂交法 该法采用基因扩增技术及导流杂交原理，通过反向点杂交检测扩增产物与包被有型特异性探针膜杂交结果，再用碱性磷酸酶系统定性检测，从而对21种HPV基因型(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304)进行分型检测分析。标本采集与DNA提取与PCR-荧光法相同，采用凯普生物化学有限公司提供的分型检测试剂盒，将PCR Mix、Taq酶和DNA模板按比例混匀。扩增参数：95 ℃ 9 min，40个循环(95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。所有产物用于杂交过程，详细步骤参照说明书操作。在显色过后检测结果阳性为清晰可见的蓝紫色圆点。根据膜条HPV分型分布图，判断阳性点为何种HPV类型。全程设立阴、阳性对照。

1.3 细胞组织学检查 根据2001年贝塞斯达分类系统(TBS)将宫颈鳞状上皮细胞学检查结果分为未见上皮内病变或恶性病变(NILM)、意义不明的非典型鳞状上皮细胞增生(ASC-H)、鳞状上皮细胞低度病变(LSIL)、鳞状上皮细胞高度病变(HSIL)和宫颈鳞癌(SCC)。

1.4 统计学处理 应用SPSS19.0 统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验和相关性分析比较两种方法的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞组织学检查结果 204例受检者中NILM 152例(74.5%)，提示存在细胞异常52例(25.5%)，其中ASC-H 27例，LSIL 21例，HSIL 2例，SCC 2例。

2.2 HPV-DNA检测结果 细胞异常组2种方法的HPV-DNA检出率均很高，PCR法检测HPV-DNA具有很高的灵敏度与特异性。PCR-荧光法检测阴性137例，阳性67例，阳性率为32.8%；NILM组检测阳性19例，阳性率为12.5%，细胞异常组检测阳性48例，阳性率为92.3%。PCR-膜杂交法检测阴性110例，阳性94例，阳性率为46.1%；NILM组检测阳性43例，阳性率为28.3%；细胞异常组检测阳性51例，阳性率为98.1%。细胞异常组患者2种方法检测HPV阳性率与NILM组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

*：与NILM组比较，P<0.05。

2.3 2种方法检测结果比较 PCR-荧光法和PCR-膜杂交法在NILM组检测阳性率分别为12.5%、28.3%，差异有统计学意义(P<0.05)；在细胞异常组检测阳性率分别为92.3%、98.1%，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨 论

从方法学来看，PCR-膜杂交法也是建立在常规PCR基础上的，增加膜杂交显色过程，其检测结果只能进行定性分析，以检测位点出现信号与否进行判断，信号点的强弱不能提供定量方面的参考。除PC位点外膜条上各检测位点有信号，说明感染了相应的基因型，即使是混合型感染也能分辨[4]。但该法比PCR-荧光法多一步杂交显色，操作步骤稍显繁琐，同时杂交显色过程中增加了实验室PCR产物污染的风险。PCR-荧光法是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，从扩增到检测完均在封闭反应管内进行，从而避免了实验室产物交叉污染的可能。PCR-荧光法可以实时荧光监测扩增过程并且能提供准确的半定量分析，结果可靠，非常适用于针对高危HPV亚型流行病学的筛查[5]。由于该法检测宫颈HPV感染具有快速、简便、准确的优点，且适用于多种样本类型，成本相对较低，在严格进行实验室质量控制的情况下，该法不失为临床HPV检测的一种理想方法[6-8]。

本研究结果显示，HPV感染在细胞组织学分类检测中呈现不同的阳性比例，NILM组明显低于细胞异常组。从表1可见，PCR-荧光法与PCR-膜杂交法检测结果均证明这一点，建立在PCR基础上的HPV-DNA检测技术具备很高的灵敏度与特异性。2种方法在细胞异常组检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明HPV感染与宫颈病变具有直接相关性。但在NILM组中2种方法检测阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，主要原因在于PCR-荧光法检测目标群只局限于13种类型的高危HPV，而PCR-膜杂交法可以检测21种类型的HPV亚型，不仅包括PCR-荧光法所含的13种高危型，还能检测5种低危型(HPV6、11、42、43、44)及2种高危型(HPV66、CP8304)[7]。

PCR-膜杂交法可以对患者所感染的HPV进行高危和低危分型，能通过一次实验检测获得相对较多的检验信息。PCR-膜杂交法可明确患者具体所感染的HPV类型，对判断多重感染和疗效监测有着较大的应用价值。但也有研究表明，只有高危型HPV基因组能整合进宿主细胞染色体内，精确的分型检测具有的临床诊疗意义不大，其在学术研究、病毒感染与组织病变的机制关系及疫苗研发方面等具有更大的应用价值[9]。PCR-荧光法与PCR-膜杂交法比较具有时间短、操作简单、交叉污染少、可以允许同一反应垫板更多具备临床意义的高危HPV类型，可适用于大批量样本的筛查[10]。同时PCR-荧光法还提供了半定量分析，检测临床标本中的病毒DNA承载量，这对于预测宫颈病变的危险程度具有一定应用价值[11]。

总之，HPV的检测方法学选择应根据患者自身病情的实际需求，选择更适合于临床诊疗需求的HPV检测方法。一方面能更快速、准确地进行检测分析；另一方面能为临床医生提供更有价值的检验信息。

参考文献：

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【文献来源】https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_international-journal-laboratory-medicine_thesis/0201224133418.html

PCR-荧光法与 PCR-膜杂交法在检测 HPV-DNA 中的比较分析