二、预期目标

总体目标

本项目的总体目标是通过系统研究胚胎激活、子宫接受性建立、蜕膜化、胎盘发育等关键事件的调控机制，使我们能更全面、深入地了解妊娠发生与发展进程中母-胎微环境的动态变化规律和分子基础，进一步加深对自发流产和先兆子痫等妊娠疾病发生机制的认识，以期为不孕不育和妊娠疾病的诊治提供理论基础和新思路。此外，项目的实施与完成也将培养一批能够独立从事高水平科学研究的后备力量，造就一支具有国际竞争力的优秀创新团队，促进我国生殖健康领域的研究。

五年预期目标

研究团队本着“资源共享、共同发展”的原则，通过本项目的实施，力争达到以下目标：

1. 在分子、细胞至组织与系统水平，更深入地了解妊娠发生与发展进程中母-胎微环境的动态变化规律和分子基础，进一步加深对自发流产和先兆子痫等妊娠疾病发生机制的认识：

✧ 揭示囊胚获得着床能力的分子基础，阐明2-4个胚源信号分子对围着床期子宫功能的调节机制。

✧ 挖掘并鉴定出2-4种子宫接受性的标志分子和蜕膜发育的关键调控分子，揭示4-6种趋化因子和关键基因在妊娠识别中的作用机制。

✧ 阐明4-6个包括胎盘源性的内分泌因子和信号通路分子在胎盘发育、滋养层细胞分化和妊娠维持中的重要作用。

✧ 建立自发流产和先兆子痫患者DNA甲基化和miRNA表达谱，建立1-2种自发流产和先兆子痫的动物模型，阐明4-6种特异基因/miRNA通过影响胚胎着床和胎盘发生关键环节引发病理性变化的作用机制。

2. 预期在国际生命科学领域有重要影响的刊物上发表论文60-80篇，其中5.0的论文20-30篇，IF>10的论文4-8篇；申请发明专利4-8项。

3. 预期培养博士研究生60-80名、硕士研究生15-20名、博士后研究人员10-20名，通过项目带动和人才引进，在全国造就一支胚胎着床与胎盘发育领域高水平的科研队伍，进一步强化发育与生殖重大研究计划北京基地的建设。

4. 进一步提升我国在胚胎着床、胎盘发育以及相关疾病领域的研究水平和国际学术地位。

三、研究方案

1. 总体思路及课题间的相互关系

本项目以“科学问题和国家需求引领学科发展”为指导思想，以“胚胎着床决定妊娠结局”为课题主线，从发育时程和生理、病理两个层面上，集合国内优势力量组建科研团队，研究胚胎与母体相互作用决定妊娠结局的分子机制。项目的总体思路和课题间的相互关系见图1。我们拟根据国家重大需求和本学科未来发展的趋势，结合现有工作基础，重点研究3个关键科学问题，并将其分解为5个方面的研究内容，利用多种转基因、组织特异性基因敲除小鼠动物模型和人类临床资源，采用高通量组学研究策略以及生物化学、细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、遗传学、表观遗传学和生物信息学等相结合的手段，系统开展胚胎激活、子宫接受性建立、蜕膜化、胎盘发育、自发流产和先兆子痫等妊娠疾病发生机制的研究。

2. 技术路线

妊娠建立和维持是一个在特定发育时相内涉及一系列复杂的细胞和分子水平相互作用的生理过程。研究其发生发展的调控机制必须从整体和在体出发，既要强调由激素主导的机体大环境的稳态，又要深入细胞与分子水平研究众多动态变化的信号分子所交织的母-胎互作微环境，基于我们已经建立的研究手段和前期工作基础，我们拟在3个技术层面，集成各种新技术和新模型，开展多学科交叉的功能与机制研究（图2）。具体技术途径如下：

分子水平的技术途径：应用RNA Seq、基因芯片、焦磷酸测序、Northern blot、原位杂交、qRT-PCR、miRNA测序、ChIP、ChIP-Seq、酵母双杂交、非标记定量蛋白质组学技术、双向电泳、蛋白印记、免疫荧光和Co-IP等技术研究基因/ miRNA/蛋白质在相应细胞和组织中的转录表达、定位、相互作用、调控及功能。

细胞水平的技术途径：综合利用已经建立的滋养层干细胞、原代和永生化的滋养层细胞、子宫内膜细胞、血管内皮细胞等体外培养体系以及胎盘绒毛外植体模型、滋养层细胞自发合体化模型、细胞浸润和迁移模型、血管内皮细胞分化模型等，应用激光共聚焦、流式分选、慢病毒介导的敲降或过表达、RNAi、体细胞基因敲除等技术，研究基因/miRNA/蛋白质的功能及调控信号网络。

动物模型的技术途径：利用转基因、整体性基因敲除、条件性基因敲除小鼠模型（PR-Cre：子宫特异性敲除；CYP19-Cre和Tpbp-Cre：胎盘特异性敲除以及相关基因的loxp小鼠）、慢病毒介导的胎盘特异基因敲降/过表达模型、胚胎延迟着床模型、假孕模型、人工诱导蜕膜化模型、去卵巢模型、小鼠四倍体胎盘模型、胚胎-子宫内膜共培养模型，结合胚胎和Affi-gel微球在体移植技术，研究关键基因/miRNA/蛋白质的在体功能和作用机制。

最后通过系统生物学和生物信息学技术对上述研究结果进行综合分析和归类，描绘和推演出在妊娠建立和维持过程中基因/miRNA/蛋白质的功能级联调控网络。

3. 取得重大突破的可行性分析

如上所述，本项目研究妊娠建立和维持的分子机制，通过系统分析国内外近10年来的研究进展和发展动态，紧扣“胚胎着床决定妊娠结局”这一突破性的理念，抓住“胚胎与母体相互作用决定妊娠结局的分子机制”这一关键的科学问题，按照发育时程的关键环节展开环环相扣的集体攻关，可以说从立题的整体思路上有很强的针对性和科学性。同时，我们拟定了周密合理和切实可行的研究方案及技术路线，汇集了国内相关领域的优秀的研究人员，依托单位将提供坚实的软硬件保障。具体体现为：

研究队伍：本项目联合计划生育生殖生物学国家重点实验室、浙江大学、武汉大学、厦门大学、吉林大学和复旦大学等单位，组成了一支优势互补的研究队伍，拥有教育部“长江学者”奖励计划特聘教授、国家杰出青年基金获得者、中科院百人计划杰出人才、教育部跨世纪人才、高校特聘教授等。课题负责人和主要研究骨干大多数都有国外留学经历，其中近50%的研究单元还分别主持和参加过生殖健康领域前两个973项目和“发育与生殖”国家重大科学计划。实施项目的研究组均具备很好的前期工作基础，对本课题的研究具有很好的掌控与应变能力。同时，主要研究骨干前期已与北京大学第一医院、北京协和医院、北京妇产医院、北京宣武医院、北京海淀医院、浙江大学医学院附属妇产科医院、厦门市第一医院等临床单位建立了良好的科研协作关系，可保证生理和病理研究的顺利实施。

仪器设备：本项目依托于计划生育生殖生物学国家重点实验室、浙江大学发育生殖医学平台（同时为浙江省生殖医学重点实验室）、复旦大学、吉林大学、武汉大学和厦门大学教育部985工程支持建设的实验室，具备了完成本项目所需要的仪器设备。

技术支持：本项目依托单位为计划生育生殖生物学国家重点实验室，是国内唯一定位于计划生育、生殖生物学基础理论研究的国家重点实验室，是国际“21世纪生殖避孕网络中心”之一及“胚胎着床研究中心”之一，也是中加生殖健康基础研究的中方协调单位。多次主办国际与国内学术讨论会与培训班，为本项目提供必要的理论与技术支持，确保本项目的顺利实施。实验室建立了较为完善的公共技术平台，在胚胎着床和胎盘发育的体内外研究模型等方面形成了自己的研究特色，并已有一定的国际学术地位。此外，各承担单位也有良好的研究条件和基础，具备了相当规模并取得了很好的科研成果，可为全面深入研究胚胎着床和胎盘发育的分子机制提供研究平台保障。

基于上述分析，我们坚信本项目的实施将大力推进我国在胚胎着床和胎盘发育领域的科研进程，有望在未来5年中取得国际瞩目的重大突破。

4. 与国内外同类研究相比的特色和创新性

相比于国内外同类研究，本项目在学术思路、组织形式和技术集成等方面均显示出独特性，主要体现为：

学术思路：“胚胎着床决定妊娠结局”这一理念是胚胎着床和胎盘发育领域近10年来的一个概念性突破，这说明在妊娠建立和维持进程中的所有关键事件如囊胚激活、子宫接受性建立、胚胎黏附、子宫蜕膜化及胎盘发育等都是相互关联而非独立的发育过程。只有将整个妊娠过程所有事件有机地统为一体，系统研究各个事件的发生机理以及级联递呈机制，才有可能真正认识整个生命的孕育过程，实现在源头上揭示不良妊娠结局的诱发机制。所以，“胚胎着床决定妊娠结局”这一理念是本项目立题的出发点，也是有别于其它项目的学术思路创新点。

组织形式：本项目以“胚胎着床决定妊娠结局”为课题主线，针对一个关键科学问题即胚胎与母体相互作用决定妊娠结局的分子机制是什么，整合国内胚胎着床和胎盘发育领域最优秀的研究人员，依据妊娠建立和维持进程关键事件的发育时序设置四个课题，集体攻关。研究团队各成员的学术背景保障了课题间能够以交叉、互补的方式开展有内涵的协同攻关，以最大限度地发挥集体效应优势。此外，课题设置将基础研究与临床问题有机结合，分别从生理与病理层面研究妊娠关键环节的调节机制，体现了“From bench to bedside, and back”的研究需求和趋势。

技术集成：本项目集成应用生物化学、细胞/分子生物学、组学、遗传/表观遗传学等传统和新兴研究技术，同时，依托于转基因、子宫/胎盘特异性基因敲除、体细胞基因敲除技术的多种动物和细胞模型也将应用于本项目研究。可见，在技术集成上，本项目相比于以往相关领域的研究有了明显的飞跃，并与国际本领域的前沿研究接轨。

5. 课题设置

围绕本项目的三个关键科学问题和五项重点研究内容，我们拟设立以下四个课题：（1）囊胚激活的分子机制；（2）子宫接受性和蜕膜化的调节机制；（3）胎盘发育与妊娠维持的分子基础；（4）着床/胎盘发育与异常妊娠的分子关联。各课题之间及其与关键科学问题和研究内容的关联见图3。其中课题1、课题2和课题3主要从生理层面、针对按照妊娠时程排序的胚胎着床与胎盘发育相关重要事件，开展既相对独立又相互关联的环环相扣的研究。课题4在保持一定独立性的前提下，作为整个项目病理层面的集中体现，将整个生理层面的三个课题有机贯穿起来

课题1：囊胚激活的分子机制

囊胚获得着床能力和子宫于同期进入接受态是胚胎能否正常植入子宫的先决条件。当前关于囊胚获得着床能力即囊胚激活的分子机制的研究仍很有限，关于来自胚胎的信号如何影响子宫功能的细节在很大程度上还处于未知状态。这主要受限于难以从啮齿类动物和人类获得足够的组织样本进行分析。随着微量蛋白质组学和RNA Seq转录组学等技术的出现，目前对着床期胚胎信号的分析已经成为可能。

主要研究内容：

1. 利用RNA Seq转录组学技术分析囊胚从休眠状态到激活状态进程中RNA的动态表达谱系。

2. 运用非标记定量蛋白质组学技术，分析建立休眠囊胚和激活囊胚的蛋白质谱系。

3. 利用胚胎和Affi-Gel微球移植技术，进一步模拟分析胚胎来源信号分子对着床进程中子宫内膜的影响。

4. 在上述实验的基础上，利用休眠囊胚体外培养技术和滋养层干细胞系，结合基因芯片分析和胚胎移植技术，探讨Wnt信号通路诱导囊胚激活的下游信号通路。

研究目标：

通过上述实验，揭示囊胚获得着床能力的分子机制和参与调节围着床期子宫功能的胚源信号及其潜在的作用方式，为发现新型的针对着床前胚胎的避孕靶点提供新的思路和侯选分子。

承担单位：中国科学院动物研究所

课题负责人：王海滨（中国科学院动物研究所）

课题参加人员：曹宇静（中国科学院动物研究所）

王凤超（中国科学院动物研究所）

雷晓华（中国科学院动物研究所）

王炳艳（中国科学院动物研究所）

经费比例：25%

课题2：子宫接受性和蜕膜化的调节机制

尽管已经证实很多因子在胚胎着床过程中起重要作用，但到目前为止，对于人子宫内膜的接受性仍然没有一个公认的指标。只有在mRNA、miRNA及蛋白质三个方面来综合考虑，才有可能找到一些在人接受期子宫内膜中特异表达的标志分子。虽然，目前已发现了大量与胚胎着床有关且相互作用的信号分子，但这些信号分子之间的级联关系仍不清楚。关于蜕膜化的诱导机制、子宫基质细胞多核化及蜕膜化与着床的关系仍有待阐明。

主要研究内容：

1. 筛选和鉴定与子宫接受性相关的标志分子。

2. 研究胚胎着床相关因子的互作机制。

3. 筛选子宫蜕膜化发育的关键调节因子，研究蜕膜细胞多核化的调节机制。

4. 研究炎症因子对蜕膜屏障功能和妊娠免疫豁免的调节机制。

研究目标：

我们拟通过上述实验，进一步了解调控子宫接受性建立、胚胎着床和蜕膜发育的分子基础，挖掘并鉴定出子宫接受性的标志分子和蜕膜发育的关键调控分子，揭示炎症趋化因子和其它关键分子在妊娠建立和维持中的作用及机制。

承担单位：厦门大学

课题负责人：杨增明（厦门大学）

课题参加人员：彭景楩（中国科学院动物研究所）

秦复牛（厦门大学）

杨颖（中国科学院动物研究所）

经费比例：21.5%

课题3：胎盘发育与妊娠维持的分子基础

胎盘是胎儿与母体进行营养物质和气体交换的临时器官。人胎盘细胞滋养层细胞有两种分化命运：发生细胞融合形成合体滋养层，分泌hCG，维持妊娠；发生形态改变形成绒毛外滋养层细胞（EVT），浸润母体子宫内膜和肌层，将胎儿锚定于子宫或改建母体血管建立胎儿-母体血液循环。EVT向浸润性的间质滋养层细胞分化过程经历上皮-间质转换(EMT)。目前，对于滋养层干细胞的分化、胎盘绒毛滋养层细胞的合体化、滋养层细胞EMT及浸润迁移和胎盘内源性分泌因子维持妊娠的调控机理的研究十分有限。揭示上述过程的作用机制将有助于进一步理解滋养层细胞分化及浸润过程紊乱相关疾病，如自发流产、葡萄胎、绒癌、先兆子痫及胎儿生长受限等的发病机理。

主要研究内容：

1. 探索滋养层干细胞分化的分子机制。

2. 研究滋养层细胞合体化的调节机制。

3. 挖掘滋养层细胞EMT、浸润和迁移的关键调节分子并研究其作用机制。

4. 胎盘源性内分泌因子维持妊娠的分子机制的研究。

研究目标：

我们拟通过上述实验，深入了解滋养层细胞发生、分化和胎盘发育的分子机制及相关各种信号途径的互作，鉴定一批调控滋养层细胞发生、分化和胎盘发育的关键因子。

承担单位：浙江大学

课题负责人：吴希美（浙江大学）

课题参加人员：孙刚（复旦大学）

林海燕（中国科学院动物研究所）

邓杨梅（浙江大学）

曹洋（复旦大学）

经费比例：24.5%

课题4：着床/胎盘发育与异常妊娠的分子关联

伴随过去20年我国社会和经济迅速发展，人们对生殖健康的需求不断增强。妊娠相关重大疾病是造成人类生殖健康水平下降的主要原因之一。同时，越来越多的证据表明多种重大成年疾病如糖尿病、高血压、心血管疾病等的发生与妊娠期胚胎在子宫内遭遇的病理环境密切相关即疾病的“胚胎编程”。自发流产、先兆子痫等妊娠相关疾病给超过30%的妊娠妇女带来危害，其发生与胚胎着床和胎盘发生障碍密切相关，但其临床指征复杂多样，发病的分子机制仍是国际生殖医学界的热点和难点问题，亟待阐明。

主要研究内容：

1. 研究胚胎着床和胎盘形成关键基因与自发流产和先兆子痫发生的关联性。

2. 通过高通量芯片分析，筛选自发流产和先兆子痫的表观遗传分子标记。

3. 利用体外模型，研究特异基因/miRNA通过影响胚胎着床和胎盘发生关键环节引发病理性变化的作用机制。

4. 建立新的自发流产和先兆子痫的动物模型，研究关键基因/miRNA的病理性改变对妊娠结局的影响。

研究目标：

我们拟通过这些研究深入了解自发流产和先兆子痫等疾病的遗传和表观遗传基础，为它们的整合性治疗提供科学的分子靶标库。

承担单位：武汉大学

课题负责人：张晓东（武汉大学）

课题参加人员：杨勇军（吉林大学）

王雁玲（中国科学院动物研究所）

徐望明（武汉大学）

杜润蕾（武汉大学）

陈 巍（吉林大学）

经费比例：29%

项目研究团队拟在5年的执行期内本着“资源共享、共同发展”的原则通力合作，通过系统研究胚胎激活、子宫接受性建立、蜕膜化、胎盘发育等关键事件的调控机制，更全面、深入地了解妊娠发生与发展进程中母-胎微环境的动态变化规律和分子基础，进一步加深对自发流产和先兆子痫等妊娠疾病发生机制的认识，最终为不孕不育和妊娠疾病的诊治提出新思路。同时，通过项目的实施与完成在全国造就一支胚胎着床与胎盘发育领域高水平的科研队伍，进一步提升我国在胚胎着床、胎盘发育以及相关疾病领域的研究水平和国际学术地位。

四、年度计划

一、研究内容

胚胎着床与妊娠结局紧密相关，但母-胎互作的机制目前还不清楚。本项目拟解决的关键科学问题是：胚胎与母体相互作用决定妊娠结局的分子机制是什么？其具体内涵为：（1）囊胚与子宫如何协同获得着床能力？（2）蜕膜与胎盘在妊娠维持中的作用机理是什么？（3）着床/胎盘发育与异常妊娠有何分子关联？针对上述科学问题，在已有的工作基础上，我们拟利用多种转基因、组织特异性基因敲除小鼠模型及人类临床资源，集成各种新技术，系统开展囊胚获得着床能力的分子基础、子宫接受性建立的调节、子宫内膜-蜕膜转化的分子机制、胎盘发育与妊娠维持的调控、自发流产和先兆子痫等妊娠疾病的发生机制等研究。

研究内容主要包括：

1. 囊胚获得着床能力的分子基础

✧ 分析囊胚获得着床能力进程中RNA/蛋白质的动态表达谱系

✧ 研究胚胎来源的信号分子对着床进程中子宫内膜的影响

✧ 探讨Wnt等信号通路诱导囊胚激活的机制

2．子宫接受性建立的调节

✧ 筛选和鉴定与子宫接受性相关的非编码RNA

✧ 探究子宫接受性关键分子的作用机理

✧ 研究胚胎着床的转录调控网络

3. 子宫内膜-蜕膜转化的分子机制

✧ 研究蜕膜化进程中基质细胞的细胞周期调控

✧ 探讨子宫蜕膜发育的表观遗传变化

✧ 研究炎症因子等对子宫内膜基质重塑和血管发生的影响

4．胎盘发育与妊娠维持的调控

✧ 研究滋养层干细胞选择性分化的关键调节因子

✧ 诠释Wnt、Notch等发育相关信号和关键基因在胎盘发育中的调节作用

✧ 探究胎盘源性内分泌因子在妊娠维持中的作用机理

5．自发流产和先兆子痫等妊娠疾病的发生机制

✧ 研究胚胎着床和胎盘形成关键基因与自发流产和先兆子痫发生的关联性

✧ 筛选自发流产和先兆子痫的表观遗传分子标记

✧ 建立自发流产和先兆子痫的新模型，阐明特异基因/miRNA引发相关病理性变化的作用机制

2011CB944400-G妊娠建立和维持的分子机制研究