第一章 绪论

一、名词解释

1、酶 ： 是具有生物催化功能的生物大分子

2、酶工程：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。它是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合而形成的新技术，是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学

3、核酸类酶：为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应

4、蛋白类酶 ： 为一类具有生物催化功能的蛋白质分子，它只能催化其他分子进行反应。

5、酶的生产：是指通过人工操作获得所需酶的技术过程。主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶，酶提取和分离纯化等

6、酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子的修饰，酶固定化，酶非水相催化等

7、酶的应用 ：是通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择和设计以及酶在各领域的应用等。

8、酶的专一性：又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即在一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。

9、酶的转换数：酶的转换数Kp。又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数

二、填空题

1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_________和 ____________两大类。

2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是__________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是________________。

3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为________________，_________________。

4、酶活力是_______________的量度指标，酶的比活力是_______________的量度指标，酶的转换数的主要组分是________________的度量指标。

5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm__________________，米氏常数Km______________。

三、选择题

1、酶工程是（ ）的技术过程。

A、利用酶的催化作用将底物转化为产物

B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶

C、酶的生产与应用

D、酶在工业上大规模应用

2、核酸类酶是（ ）。

A、催化RNA进行水解反应的一类酶

B、催化RNA进行剪接反应的一类酶

C、由RNA组成的一类酶

D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶

3、RNA剪切酶是（ ）。

A、催化其他RNA分子进行反应的酶

B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶

C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶

D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶

4、酶的改性是指通过各种方法（ ）的技术过程。

A、改进酶的催化特性 B、改变酶的催化特性

C、提高酶的催化效率 D、提高酶的稳定性

5、酶的转换数是指（ ）。

A、酶催化底物转化成产物的数量

B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数

C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数

D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数

四、判断题

（ ）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。

（ ）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。

（ ）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。

（ ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。

（ ）5、水解酶在水溶液中不能催化其逆反应。

五、简答题

1、何谓酶工程，其主要内容有哪些？

2、试述酶活力测定的基本步骤。

3、简述影响酶催化作用的主要因素。

参考答案

第一章

一、 填空题

1、 蛋白类酶，核酸类酶。

2、 蛋白质，核糖核酸。

3、 自我剪切酶，自我剪接酶。

4、 酶量，酶纯度，酶催化效率。

5、 减小，不变。

二、 选择题

1、C 2、D 3、B 4、A 5、C

四、判断题

1、（X） 2、（√ ） 3、（X） 4、（X） 5、（√ ）

五、简答题

1、答：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。

酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。

2、答：酶活力测定通常包括两个阶段。首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤：

（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。。

（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择在室温（25℃）、体温(37℃)、酶反应最适温度或其他选用的温度；pH应是酶催化反应的最适pH；底物浓度应大于5Km等。

（3）在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。

（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

3、答：酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。

（1）底物浓度：在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。

（2）酶浓度：在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。

（3）温度的影响：每一种酶的催化反应都有其适宜的温度范围和最适温度。在适宜温度范围内，酶才能进行催化反应；在最高温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。

（4）pH的影响：酶的催化作用与反应液的pH有很大关系。每一种酶都有各自的适宜pH范围和最适pH。只有在适宜pH范围内，酶才能显示其催化活性在最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。

（5）抑制剂的影响：在抑制剂的条件下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂之分。不可逆性抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性难以恢复。可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。

（6）激活剂的影响：在激活剂的影响下，酶的催化活性提高或者由无性得酶原生成有催化活性的酶。

第二章 微生物发酵产酶

一、 名词解释

1、酶的发酵生产 ：经过预先设计，通过人工操作，利用为生物的生命活动获得所需酶的技术过程

2、转录 ：是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程

3、翻译 ：以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖体蛋白体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。

4、酶的诱导：加入某些物质使酶的生物合成或加速进行的现象。

5、酶的反馈阻遏：是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成收到阻遏。

6、分解代谢物阻遏 ：

7、发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速度，产物形成速度、基质消耗速度以及环境因素对速度的影响；在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义

二、填空题

1、转录是以　　　　  　    为模板，以　　　　  　    为底物，在　　　　  　    的作用下生成　　　　  　    的过程。

2、微生物产酶方式可以分为同步合成型，　　　　  　    中期合成型，　　　　  　    四种。

3、生长因素是　　　　  　    所必需的　　　　  　    。

4、莫诺德常数Ks是指生长速率达到　　　　  　   时的　　　　  　    。

5、发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率，　　　　  　   ，基质消耗速率及其影响因素的学科。

三、选择题

1、可以通过添加（ ）使分解代谢物阻遏作用解除。

A、诱导物 B、激活剂 C、cAMP D、ATP

2、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以（D ）。

A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成

C、提高酶活力 D、提高细胞透过性

3、有些酶在细胞进入平衡期以后还可以继续合成较长的一段时间，这是由于（ ）。

A、该酶所对应的mRNA稳定性好 B、该酶所对应的DNA稳定性好

C、细胞自溶后使酶分泌出来 D、培养基中还有充足的营养成分

4、莫诺德常数是指（ ）

A、反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

B、比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

C、产酶速率达到最大产酶速率一半时的限制性基质浓度。

D、细胞生长速率达到最大细胞生长速率一半时的限制性基质浓度。

四、判断题

（ ）1、固定化细胞在一定的空间范围内生长繁殖，由于细胞密度增大，使生化反应加速，所以能够提高酶活力。

（ ）2、某些酶的催化反应产物可以诱导该酶的生物合成。

（ ）3、在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的酶合成方式是延续合成型。

（ ）4、氨酰-tRNA合成酶具有识别mRNA和tRNA的功能。

（ ）5、固定化原生质体与固定化细胞一样可以进行生长繁殖和新陈代谢。

五、简答题

1、为什么属于滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？

2、简述微生物发酵产酶培养基的主要组分及其作用。

3、简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的限制性。

4、固定化细胞发酵产酶有哪些特点？

5、固定化微生物原生质体发酵产酶有哪些特点？

6、试述酵发酵动力学的主要内容。

六、综合分析题

1、在酵发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？

第二章参考答案

二 填空题

1 DNA,核苷三磷酸，依赖DNA的RNA聚合酶，RNA 2 延续合成型，滞后合成型

3 细胞生长繁殖，微量有机化合物 4 最大比生长速率一半，限制性基质浓度

5 产物生成速率

三选择题

1C 2D 3A 4B

四判断题

1错 2 对 3 对 4 错 5错

五简答题

1 答：属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期后才开始合成，主要有两个原因：一是由于酶的生物合成受到培养基中阻遏作用，只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而解除阻遏以后，酶才开始大量合成；二是由于该类型酶对所对应的mRNA稳定性好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。

2 答：培养基的主要组成包括：碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。在一般情况下，碳源也是为细胞提供能量的能源。碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。所以碳源是酶的生物合成法生产中必不可少的营养物质。

氮源是指能向细胞提供氮元素的营养物质。氮元素是各种细胞中蛋白质。核酸等组分的重要组成元素之一，也是各种酶分子的组成元素。氮源是细胞生长、繁殖和酶的生产的必不可少的营养物质。

无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的PH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。

生长素是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅助酶或辅基的组分；维生素主要是起辅酶作用。

3 答：微生物发酵产酶的过程中，必须根据需要和变化情况，适时进行PH、温度、溶解氧等发酵工艺条件的控制。

（1）PH的调节控制

（2）温度的调节控制

（3）溶解氧的调节控制

4答：固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有下列显著特点：

（1） 提高酶产率

（2） 可以反复使用或连续使用较长时间。

（3） 基因工程菌的质粒稳定，不易丢失

（4） 发酵稳定性好

（5） 缩短发酵周期，提高设备利用率产品容易分离纯化：固定化细胞不溶于水，发酵完成后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含的游离细胞很少，这就有利于产品的分离纯化，从而提高产品的纯度和质量。

（6） 适用于胞外酶等胞外产物的生产。

5答：固定化原生质体发酵产酶具有如下显著特点：

（1） 变胞内产物为胞外产物

（2） 提高酶产率

（3） 稳定性好

（4） 易于分离纯化。

6答：发酵动力学的主要内容包括细胞生长动力学，产物生成动力学和基质消耗动力学。

细胞生长动力学主要研究发酵过程中细胞生长速率以及各种因素对细胞生长速率的影响规律；产物生成动力学主要研究发酵过程中产物生成速率以及各种因素对产物生成速率的影响规律；基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种因素对基质消耗速率的影响规律。

六 综合分析题

1答：在酶的发酵生产过程中，要使酶的产率提高，必须采取一系列的措施，主要的有：

（1） 使用优良的产酶细胞：通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组、定向进化等手段，获得生长快、产率高、稳定性好的产酶细胞。

（2） 使用优良的发酵生产设备：通过精心设计或者选择使用高产、低耗的发酵罐等发酵生产设备。

（3） 采用先进的跟李纯化技术和设备：采用操作简便、收得率高的分离化技术设备，以达到高产丰收的效果。

（4） 控制好工艺条件：在发酵过程中，要根据菌种特性，确定培养基和发酵工艺条件，进行工艺优化，并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。

（5） 此外还可以采取某些行之有效地措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂 等。

第三章 动植物细胞培养产酶

一、名词解释

1、动物细胞培养产酶：

2、植物细胞培养产酶

3、抗体酶：又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子

4、纤维酶原激活剂

二、填空题

1、植物细胞培养主要用于生产色素、香精、　　药物    、　　酶　  　    、等次级代谢产物。

2、动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等　　功能性蛋白质   。

3、抗体酶的主要获得方法有修饰法、　　引入法 　    、酶蛋白抗原诱导法。

4、植物细胞和微生物细胞的特性差异主要有细胞体积大，生长倍增时间长，营养要求较简单，大多数需要光照，　对剪切力敏感    等显著特点。

5、动物细胞培养方法主要有悬浮培养，　贴壁培养 　   ，　固定化细胞培养   。

三、选择题

1、半抗原（ ）可以不做

A、可以诱导抗体生成，但不能与抗体特异结合

B、可以与抗体特异结合，但不能诱导抗体生成

C、可以诱导抗体产生，也可以与抗原特异结合

D、不能与抗体特异结合，也不能与抗体特异结合

2、端粒酶是（ C）

A、催化端粒水解的酶

B、存在于端粒中的酶

C、催化端粒生成和延长的酶

D、催化RNA生成和延长的酶

3、抗体酶是（ A）

A、具有催化活性的抗体分子

B、具有催化活性的RNA分子

C、催化抗体水解的酶

D、催化抗体生成的酶

4、纤溶酶原激活剂是（ D）

A、催化纤溶酶水解反应的酶

B、催化纤维蛋白水解反应酶

C、催化纤维蛋白原水解反应酶

D、催化纤溶酶原水解反应的酶

四、简答题与计算题

2、何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。

抗体酶又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。要使抗体成为具有催化功能的抗体酶，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，就可能成为抗体酶。抗体酶的制备方法有诱导法、修饰法，诱导法是抗体酶制备的主要方法，根据所采用的抗原不同，诱导法有半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。

3、植物细胞培养有何特点？

植物细胞培养特点（与直接提取分离相比较而言）：

（1）提高产率；

（2）缩短周期；

（3）易于管理、减轻劳动强度；

（4）提高产品质量。

4、举例说明植物细胞培养产酶的工艺流程。（Page76）

工艺流程：1、外植体的选择2、植物细胞的获取3、细胞培养4、分离纯化5、得到产物

以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例

(1)大蒜愈伤组织的诱导：选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。

在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。

(2)大蒜悬浮细胞培养：将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。

然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。

(3)酶的分离纯化：细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。

5、试述植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制。

（2）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：大量无机盐、维生素和植物生长激素、无机氮源、碳源（蔗糖）、MS培养基和B5培养基

（3）温度和pH值

（4）溶解氧的调节（通风与搅拌）

（5）光照

（6）前体的添加

（7）刺激剂的应用

6、试述动物细胞培养的特点。

1、生长缓慢

2、培养中需防止微生物的污染

3、根据细胞的来源选择适当的培养方式

4、培养基成份复杂，成本较高

5、原代细胞培养50代后会退化死亡

6、动物细胞没有细胞壁，显得十分脆弱，必须小心地控制温度、pH值、渗透压以及溶解氧等外界条件。

7、动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？

1、培养基中必须添加氨基酸

2、温度要求严格，一般控制在36.5℃，允许波动为0.25 ℃

3、pH调节的缓冲体系：CO2与NaHCO3系统 HEPES系统

4、渗透压的调节

第四章 酶的提取与分离纯化

一、 名词解释

1、细胞破碎:许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 包括机械破碎,物理破碎：化学破碎：酶促破碎

2、酶的提取：是指将酶或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需求的酶制品过程

3、沉淀分离：使溶液中的溶质由液相转变为固相析出，古老、实用、简单的初步分离方法

4、层析分离：层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。

5、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

6、亲和层析：由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析. 生物专一吸附，选择层析，利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。

7、离心分离：离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。是最常用的一种方法。

8、电泳：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。

9、萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。

10、双水相萃取：又称水溶液两相分配技术，用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

11、超临界萃取：利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质分开

12、过滤：借助于过滤解质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。包括膜过滤和非膜过滤。

13、膜分离技术：大部分微滤以及超滤，反渗透，透析，电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤，又称为膜分离技术。

14、结晶：是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。结晶既是酶是否纯净的标志（只有同类分子才能形成晶体），也是一种酶和杂蛋白分离的方法。

二、填空题

1、细胞破碎的主要方法有机械破碎，物理破碎，　　化学 　    ，　　酶促  　    。

2、酶的提取方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，　　　　  　    。

3、结晶的方法主要有　盐析结晶 　    ，有机溶剂结晶法，透析平衡结晶法，等电点结晶法。

4、离心方法主要有差速离心，　密度梯度离心    ，　等密度梯度离心   。

5、加压膜分离可以分为微滤，　超滤　  　    ，反渗透。

6、常用的萃取方法有有机溶剂萃取，双水相萃取，　超临界萃取　    ，反胶束萃取。

7、按照凝胶的组成系统不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为连续凝胶电泳，不连续凝胶电泳，浓度梯度凝胶电泳，　SDS-凝胶电泳　　　  　    。

8、在CO2超临界萃取中，目标产物的分离方法主要有等压分离，等温分离，　吸附分离 　    。

三、选择题

1、酶的提取是（ C）的技术过程。

A、从含酶物料中分离获得所需酶

B、从含酶溶液中分离获得所需酶

C、使胞内酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中

D、使酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中

2、在凝胶层析的洗脱过程中，（ A）

A、分子质量最大的分子最先流出

B、分子质量最小的分子最先流出

C、蛋白质分子最先流出

D、盐分子最先流出

3、超临界流体能够用于物质分离的主要原因在于（ C）

A、超临界流体的密度接近于液体

B、超临界流体的黏度接近于液体

C、在超临界流体中不同物质的溶解度不同

D、超临界流体的扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍

4、在等电点聚集电泳系统中，形成pH梯度的主要原因是（ B）

A、系统中有pH梯度支持介质

B、系统中有两性电解质载体

C、系统中有不同等电点的蛋白质

D、系统中阳极槽装酸液，阴极槽装碱液

四、简答题

1、简述酶沉淀分离的主要方法及其原理。

沉淀分离方法 分 离 原 理

盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离

等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离

选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离

2、何谓膜分离技术？在酶的生产中有何应用？

膜分离技术：大部分微滤以及超滤，反渗透，透析，电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤，又称为膜分离技术。应用，除菌，分离病毒及生物大分子，纯水制备，透 析

应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。

3、简述双水相萃取的概念与特点。

双水相萃取：又称水溶液两相分配技术，用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

优点：

　　①　每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；

　　②　PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。

4、简述超临界萃取的概念与特点。

超临界萃取：利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质分开。1）在超临界流体(SCF)中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。

2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。

常用超临界液态CO2作为萃取剂，其主要特点是：

①由于一般采用CO2作为超临界流，它无毒、无味、不燃、价廉，对环境和产品不会产生任何污染；

②由于CO2的临界温度为31℃，萃取操作可以在接近常温的条件下进行，超临界流体萃取技术特别适用于对温度敏感，在高温下品质易发生变化的产品的加工；

③由于CO2对产品不产生污染，且极易与产品完全分离，故可省去复杂的脱除溶剂工艺，缩短工艺流程，降低投资和操作费用；

④选择性好,且产品中没有溶剂残留，提高产品的收率、浓度和纯度。

5、 试述凝胶层析的原理与操作要点。

凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography），是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；

小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

凝胶层析操作⑴凝胶的选择和处理⑵柱的选择⑶加样⑷洗脱及酶活检测⑸胶的保存

第五章 酶分子修饰

一、 名词解释

1、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的的结构发生某些改变，从而改变酶催化特性的技术过程。

2、金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。

3、大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合。，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

4、肽链有限水解修饰：在肽链的限定为点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法。

5、核苷酸链剪切修饰：在核苷酸链的限定为点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

6、酶的侧链基团修饰：采用一定的方法（一般为化学法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

7、氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

8、定点突变：是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

9、核苷酸置换修饰：将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸置换成另一个核苷酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

10、酶的物理修饰：通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

二、填空题

1、定点突变是在DNA序列的　特定位点    进行碱基的改变，从而获得　　突变基因　    的操作技术。

2、锤头型核酸类酶含有　　13  　    个保守核苷酸残基和　3 　    个螺旋结构域。

3、酶分子的物理修饰是通过物理方法改变酶分子的　空间构象 　    ，从而改变酶的　特性和功能　    。

4、通过人工方法获得的具有催化RNA水解的单链DNA分子，称为　脱氧核酸类酶   。

三、选择题

1、氨基酸置换修饰通常采用（ A）技术进行

A、定点突变

B、定向进化

C、化学诱变

D、物理诱变

2、金属离子置换修饰是将（ D）中的金属离子用另一种金属离子置换

A、酶液

B、反应介质

C、反应体系

D、酶分子

3、酶分子的物理修饰是通过物理方法改变酶分子的（ C）而改变酶的催化特性

A、组成单位

B、侧链基团

C、空间构象

D、空间构型

4、氨基酸修饰（ B ）的分子修饰

A、只能用于核酸类酶

B、只能用于蛋白类酶

C、可以用于蛋白类酶和核酸类酶

D、不能用于蛋白类酶和核酸类酶

四、判断题

（ ✗ ）1、只有以金属离子为激活剂的酶，才可以进行金属离子置换修饰。

（ ✓ ）2、通过改变酶分子的空间构象而改变酶的催化特性的修饰方法称为物理修饰法。

（ ✓ ）3、定点突变技术是氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰的主要方法。

（ ✓ ）4、某些RNA分子，经过核苷酸剪切修饰，可以成为核酸类酶。

五、简答题

1、试述酶分子修饰的概念和作用。

答：酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的的结构发生某些改变，从而改变酶催化特性的技术过程。

作用：通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就可能提高酶的催化效率，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性，改变酶的底物专一性等。同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子种主链，侧链，组成单位，金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探索其结构和催化特性之间的关系，所以，酶分子修饰在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。

2、何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用。

金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。

主要修饰过程：

（1） 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的每液。

（2） 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，是酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析，超滤分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成无活性状态。

（3） 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到进过金属离子置换后的酶。

作用：（1）阐明金属离子对酶催化作用的影响

（2）提高没的催化效率

（3）增强酶的稳定性

（4）改变酶的动力学特性

3、何谓大分子结合修饰？有何作用？

大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合。，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

作用：（1）通过修饰提高酶的催化效率。

（2）通过修饰可以增强没的稳定性

（3）通过修饰降低或消除酶的抗原性

5、何谓氨基酸置换修饰？有何作用？

氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

作用：（1）通过修饰可以提高没的催化效率。

（2）通过修饰可以增强酶的稳定性

（3）通过修饰可以使酶的专一性发生改变

6、何谓核苷酸置换修饰？有何作用？

核苷酸置换修饰：将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸置换成另一个核苷酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

作用：（1）可以使酶的底物专一性改变

（2）获得各种不同的人造核酸类酶。

@@7、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。

答：定点突变是在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下：

（1）新的酶分子结构的设计

（2）突变基因碱基序列的确定

（3）突变基因的获得

（4）新酶的获得

定点突变技术在酶分子修饰中试一种行之有效的常用方法，定点突变技术为氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰提供了先进、可靠的手段。

8、酶分子的物理修饰有何特点？

第六章 酶、细胞、原生质体固定化

一、 名词解释

1、固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。

2、固定化细胞：固定在载体上的细胞称为固定化细胞。

3、固定化原生质体：固定在载体上并在一定空间范围内进行新城代谢的原生质体。

4、吸附法：利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。

5、包埋法：将细胞包埋在多空载体内而制成固定化细胞的方法。

6、结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。

7、交联法：借助双功能试剂是酶分子之间发生交联作用，制成网状结构 的固定化酶。

二、填空题

1、固定化酶是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的　催化反应的　    酶。

2、固定化细胞是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的　生命活动的　    细胞。

3、固定化原生质体是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的　生命活动　　　  　    原生质体。

4、用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH　　偏碱　    ，用带正电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH　　偏酸  　    ，用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH与游离酶的最适pH　　不变  　    。

5、酶催化反应的产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH　　高 　    ，产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH　　　低  　    ，产物为中性时，最适pH　　不变  　    。

6、酶电极是由　　固定化酶     与　能量转换器　    密切结合的传感装置。

三、选择题

1、用带负电荷的载体制备的固定化酶后，酶的最适pH（ A）。

A、向碱性一侧移动

B、向酸性一侧移动

C、不改变

D、不确定

2、氨基酰化酶可以催化（ B）。

A、D，L-氨基酸生成D-氨基酸和L-氨基酸

B、D,L-乙酰氨基酸水解生成D,L-氨基酸

C、L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸

D、D-乙酰氨基酸水解生成D-氨基酸

3、酶催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH（ B）

A、比游离酶的最适pH高一些

B、比游离酶的最适pH低一些

C、与游离酶的最适pH相同

D、随机变化

4、制备酵母原生质体时主要采用（ D）

A、溶菌酶

B、果胶酶

C、B-1，4葡聚糖酶

D、B-1，3葡聚糖酶

四、判断题

（ ✓ ）1、包埋法可以用于酶、细胞和原生质体的固定化。

（ ✓ ）2、固定化原生质体由于细胞内的结构完整，可以保持细胞原有的生命活动能力。

（ ✗ ）3、延胡索酸酶催化延胡索酸水合反应的酶。

（ ✗ ）4、采用共价结合法制备得到的固定化细胞具有很好的稳定性。

五、简答题

1、简述常用的固定方法及其应用范围。

答：（1）、吸附法：利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固容易脱落，所以使用受到一定的限制。

（2）包埋法：将细胞包埋在多空载体内而制成固定化细胞的方法。包括a凝胶包埋法 不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。广泛用于细胞固定化中。b半透膜包埋法，适用于底物或产物都是小分子物质的酶的固定，如脲酶，天冬酰胺酶，尿酸酶，过氧化氢酶等。

（3）、结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。分为a离子结合法 由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体结合不牢固，在PH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以使用时一定要严格控制好PH，离子强度和温度等操作条件。b 共价结合法 使用此法制备的固定化酶，结合很牢固，不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂比较麻烦，同时由于共价结合时可能因影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。

（4）交联法：借助双功能试剂是酶分子之间发生交联作用，制成网状结构 的固定化酶。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用，但由于交联反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。

（5）热处理法：是将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体的方法。 只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。

2、何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶的比较有哪些改变？

答：固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。

1）固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现如下：

（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。

（2）保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间.

(3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。

（4）对变性剂的耐受性提高，在尿素，有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂作用下，仍可保留较高的酶活力等。

2）固定化酶的最适温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶会有较明显的改变。

3）酶过固定化后。其作用的最适PH往往会发生一些改变。一般来说催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适PH比游离酶的最适PH高一些。一般来说催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适PH比游离酶的最适PH低一些。

4）底物特异性 两者的底物特异性可能有些不同，其变化与底物分子质量的大小有一定关系。对于那作用于小分子底物的酶，固定化前后的特异性没有明显变化，而对于那些既可以作用于小分子底物，又可以作用于大分子底物的酶来说，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。

4、何为固定化细胞？固定化细胞有何特点及应用？

答：固定化细胞：固定在载体上的细胞称为固定化细胞。

1）微生物细胞固定化

特点：（1）固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然构象，可以进行正常的生长繁殖。

（2）固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系，辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有限的代谢调节控制。

（3）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长时间。

（4）固定化微生物细胞密度的提高，可以提高产率。

（5）由于有载体的保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性。

应用：一方面是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外，另一方面是利用固定化微生物细胞与各种电极合制成微生物电极（生物传感器）

2）植物细胞固定化

特点：（1）植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响。

（2）细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。

（3）固定化植物细胞发酵可以在不同的培养阶段简便地更换不同的培养液，即首先在生长培养基上生长增值，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。

（4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。

（5）固定化植物细胞易于与培养液分离利于产品的分离纯化，提高产品质量。

应用：对种质保存具有重要意义，还可以用于生产各种色素，香精，药物，酶等次级代谢物，一般仅适用于可以分泌到细胞外的产物的生产。对于细胞内产物，则要想办法增加细胞的透过性，使胞内产物分泌到保外。

3）动物细胞固定化

特点：（1）提高细胞存活率

（2）提高产率

（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间。

（4）固定化植物细胞易于与培养液分离利于产品的分离纯化，提高产品质量

应用：在动物细胞中大部分为贴细胞，需要贴附在载体表面才能正常生长，所以固定化动物细胞得到广发应用。特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化，主要用于生产小儿麻痹症疫苗，风疹疫苗，狂犬病疫苗，痳疹疫苗，黄热病疫苗，肝炎疫苗，生长激素，干扰素，胰岛素，前列腺素，以及皮肤，心脏等各种组织器官。

5、简述固定化原生质体的制备方法与特点。

答：制备方法：（1）琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法

（2）海藻酸钙凝胶固定化法

（3）角叉菜胶固定化法

（4）光交联树脂固定化法

特点：（1）固定化原生质体由于没有细胞壁，细胞结构不完整，失去增值能力，但由于细胞膜内的结构没有受到影响保持了细胞原有的新陈代谢能力。

（2）固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质传递和吸收，也有利于胞物质的分泌，可显著提高产率。

（3）固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。

（4）固定化原生质体易于与发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。

(5)在固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可以用层析或膜分离技术等方法与产物分离。

六、综合分析题

1、试分析固定化酶与固定原生质体有哪些异同点？

第七章 酶非水相催化

一、 名词解释

1、 酶非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用，酶的非水相催化是通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改进酶的催化特性。

2、 有机介质中的酶催化：酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应，适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

3、 微水介质体系：是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。

4、 水活度：是指体系中水的逸度与纯水逸度之比，通常可用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。

二、填空题

1、与在水介质中相比，酶在有机介质中的稳定性　增加　  　    ，催化活性　不变　  　    。

2、非水介质主要包括有机介质，气相介质，超临界流体介质，　离子液介质　    。

3、有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性　　越大  　    ，对酶活性的影响　　越大  　    。

4、化学组成相同，立体结构互为对映体的两种异构体化合物称为　外消旋化合物    。

5、脂肪酶可以催化油脂与甲醇进行　油脂　  　    反应，生成生物柴油。

三、选择题

1、必需水是指（ D）

A、维持酶催化反应速度所必需的水量

B、酶催化反应速度达到最大时所需的水量

C、与酶分子紧密结合的水量

D、维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量

2、有机介质中酶催化的最适水含量是（ C）

A、酶溶解度达到最大时的含水量

B、底物溶解度最大时的含水量

C、酶催化反应速度达到最大时的含水量

D、酶活力到最大时的含水量

3、有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示，极性系数越大，（ D）。

A、表明其极性越强，对酶活性的影响就越大

B、表明其极性越强，对酶活性的影响就越小

C、表明其极性越弱，对酶活性的影响就越大

D、表明其极性越弱，对酶活性的影响就越小

4、天苯肽是由（ A）缩合而成。

A、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基

B、L-天冬氨酸的B-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基

C、L-天冬氨酸的氨基与L-苯丙氨酸的a-羧基

D、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸的氨基

四、判断题

（ ✓ ）1、有机溶剂的极性系数是指某种溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数

（ ✓ ）2、在有机介质反应体系中，水活度越大，酶催化反应速度也越大。

（ ✗ ）3、酶在水溶液中催化的立体选择性通常比在有机介质中催化的立体选择性强。

（ ✗ ）4、酶在有机介质中催化的最适pH与在水溶液中催化的最适pH有较大差别。

五、简答题

1、酶在非水相中有哪些特点？

1) 热力学稳定性

2) 底物特异性

3) 对映体选择性：

4) 位置选择性

5) 化学键选择性

6) pH记忆

2、酶在有机介质中与在水溶液中的特性有何改变？

1）在水溶液中，对疏水性较强的底物，酶的底物专一性较强，而在有机介质中，底物专一性较弱。

2）酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。

3）热稳定性增强

4）区域选择性与溶剂的疏水性相关

5）键选择性也有所改变

3、什么是必需水和水活度？它们对非水相中酶的催化有何影响？

水活度：是指体系中水的逸度与纯水逸度之比，通常可用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。

必需水：维持分子完整的空间构象所必须的最低水量。

4、简述有机介质中酶催化反应的影响因素及其控制。

影响因素：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类、水含量、pH和离子强度等。

控制：

水含量：最适含水量水活度控制在0.5-0.6

有机溶剂：是影响酶在有机介质中催化的关键因素之一。

应选择2≤lgP ≤5的溶剂

最适温度：酶的稳定性增强，最适温度高于水溶液中的催化温度

但是温度过高，其立体选择性降低

酶：选择好使用的酶，注意酶的稳定性

底物：根据底物的极性，结合有机溶剂的选择控制好酶的溶解，使底物持续维持在一定的浓度范围内

第八章 酶定向进化

一、 名词解释

定向进化：是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。

酶定向进化：是模拟自然进化过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的过程。

易错PCR技术：是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应，是扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

DNA重排技术：又称DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

二、填空题

1、定向进化按照进化对象的不同，可以分为　分子定向进化   ，　　细胞定向进化   。

2、酶定向进化是在体外进行酶基因的　随机突变 　    ，然后在人工控制条件的特殊环境下进行　选择　  　    ，而得到具有优良催化特性的酶的突变体。

3、易错PCR技术是从酶的　单一基因　　    出发，在　特定的反应条件下 　    的情况下进行的聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现剪辑配对错误，而引起基因突变的技术过程。

4、DNA重排技术将2种以上同源基因中的正突变结合在一起，通过DNA的碱基序列的　重新排布　    ，形成新的突变基因。

5、要从突变基因文库中筛选得到人们所需的正突变基因，筛选工作量很大，必需采用各种　高通量的筛选技术  　    。

6、插入B-半乳糖苷酶基因片段的噬菌体DNA，转染大肠杆菌细胞后，在含有诱导酶　IPTG  　    和底物X-gal的平板培养基上可以形成　　　白色　  　    细菌斑。

三、选择题

1、在获得酶的单一基因以后，可以采用（ A ）技术获得两种以上同源正突变基因。

A、易错PCR

B、交错延伸PCR

C、DNA重排

D、基因组重排

2、在进行易错PCR时，提高镁离子浓度的作用是（ B ）。

A、稳定互补的碱基对

B、稳定非互补的碱基对

C、增强酶的稳定性

D、减弱酶的稳定性

3、在进行易错PCR时，添加一定浓度的锰离子，其作用是（ A ）。

A、降低DNA聚合酶对模板的特异性

B、提高DNA聚合酶对模板的特异性

C、增强DNA聚合酶的稳定性

提高DNA聚合酶的活力

四、判断题

( ✗ )1、外源蛋白基因可以与噬菌体的外膜结构蛋白基因形成融合蛋白基因，在噬菌体表面展示

（ ✗ ）2、重组质粒载体可以通过细胞转化方法将重组DNA转入受体细胞

（ ✓ ）3、通过DNA重排技术进行酶基因的体外随机突变，可以获得大量的正突变基因。

（ ✓ ）4、基因家族重排技术需要经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变。

五、简答题

@@1、何谓酶定向进化？有何特点？

特点：1）适应面广

2）目的性强

3）效果显著

2、简述易错PCR技术与常规PCR技术的异同点。

相同点：过程相同1.变性：85-95度解链；2.退火：50-70度，引物与模板互补配对；3.70-75度 引物延伸一般30个循环。

不同点：易错PCR技术：1 镁离子浓度高，稳定非互补的碱基对；2 猛离子：降低聚合酶的特异性；3 四种底物浓度比改变。改变反应条件，增加了碱基配对错误的出现频率。

3、什么叫DNA重排技术？其主要过程包括哪些步骤？

过程：将两条以上正突变基因通过脱氧核糖核酸酶I等酶的作用，随机切割成若干DNA片段，然后将这些随机片段在不加引物的条件下经过多次PCR循环，获得突变基因，然后构建突变基因文库，进而进行筛选获得正突变基因，正突变基因在反复经过上述步骤，直打获得所需的突变基因为止

第九章 酶反应器

一、 名词解释

1酶反应器 以游离酶或固定化酶、固定化细胞作为生物催化剂，进行催化反应的容器及其附属设备。

2搅拌罐式反应器：带有搅拌装置的一种罐式搅拌器。

3、 填充床式反应器 将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。

4、 流化床式反应器 底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处浮动状态下进行反应。

5、 鼓泡式反应器 利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。

6、 膜反应器 将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器

7、 喷射式反应器 通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应

一、

二、填空题

1、搅拌罐式反应器主要由反应罐，　搅拌器  　    和温度调节装置组成。

2、填充床式反应器是通过　底物溶液    的流动，实现物质的传递和混合。

3、鼓泡式反应器是　有气体参与　    的酶催化反应中常用的一种反应器。

4、膜反应器是将酶的　催化反应 　    与半透膜的　分离作用 　    组合在一起而成的反应器。

6、 喷射式反应器是利用　高压蒸汽 　    的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行　高温短时 　    催化反应的一种反应器。

三、选择题

1、流化床反应器（C ）。

A、适用于游离酶进行间歇催化反应

B、适用于固定化酶进行间歇催化反应

C、适用于游离酶进行连续催化反应

D、适用于固定化酶进行连续催化反应

2、膜反应器是（ A）的酶反应器

A、将酶催化反应与膜分离组合在一起

B、利用酶膜进行反应

C、利用半透膜进行底物与产物分离

D、利用半透膜进行酶与产物分离

3、对于有产物抑制作用的酶，最好选用（C）反应器

A、搅拌罐式

B、喷射式

C、膜反应器

D、鼓泡式

4、对于有气体参与反应的酶，通常采用（ C）反应器

A、填充床式

B、流化床

C、鼓泡式

D、搅拌罐式

四、判断题

（ ✓ ）1、填充床式在任何一个横截面上的流体流动速度都相同，在同一个横截面上底物浓度与产物浓度也一致，又称为活塞流反应器。

（ ✗ ）2、需要小分子物质作为辅酶的酶催化反应，通常采用膜反应器。

（ ✓ ）3、鼓泡式固定化酶反应器又称为三相流化床式反应器。

（ ✓ ）4、采用膜反应器进行酶催化反应，可以明显降低小分子产物对酶的反馈抑制作用。

五、简答题

1、1、简述酶反应器的主要类型和特点。

2、选择酶反应器的主要依据有哪些？

酶反应器多种多样，在应用时，应当有所选择。选择一种结构简单、操作简便、制造成本和运行成本底的特点。主要根据酶的应用形式、反应动力学性质、底物或产物的理化性质进行选择。

3、简述酶反应器设计的主要内容。

4、简述酶反应器的操作条件及其控制的主要内容。

5、在酶反应器的操作过程中要注意哪些问题？

第十章 酶的应用

一、 名词解释

酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者除去不良物质的技术过程，

酶学诊断：通过酶的催化作用测定体内某些物质的含量及其变化，或者通过体内原有酶活力的变化情况进行疾病诊断的方法

药用酶：酶制剂作为分子水平的治疗药

二、填空题

1、酶的应用是通过　酶的催化作用    获得　所需物质 　    或除去不良物质、得到所需信息的技术过程。

2、纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，可以催化　纤溶酶原 　    水解生成　　纤溶酶　　  　    。

3、青霉素酰化酶可以催化青霉素水解生成　6-氨基青霉烷酸  。

4、溶菌酶是一种催化细菌细胞壁中的　肽多糖  　    水解的水解酶。

5、利用丙烯氰为原料，在　腈水和酶　    催化下，可以水合生成　丙烯酰胺 　    。

三、选择题

1、葡萄糖氧化酶可以用于食品保鲜，主要原因是通过该酶的作用可以（ D）。

A、生成过氧化氢

B、生成葡萄糖酸

C、杀灭细菌

D、除去氧气

2、亚硝酸还原酶是以催化亚硝酸还原生成（ A）的氧化还原酶。

A、NO

B、NO2

C、N2

D、HNO3

3、乳糖酶可以催化乳糖水解生成（ C）。

A、二个半乳糖

B、葡萄糖和果糖

C、半乳糖和葡萄糖

D、半乳糖和果糖

4、胆碱酯酶可以用于检测有机磷农药污染，是由于（ B）。

A、有机磷农药是胆碱酯酶的一种激活剂

B、有机磷农药是胆碱酯酶的一种抑制剂

C、胆碱酯酶可以催化有机磷分解

D、胆碱酯酶可以催化胆碱酯分解

四、判断题

（ ✓）1、葡萄糖异构酶可以催化D-木糖可逆地转化为D-木酮糖。

（ ✓ ）2、果胶酶是催化果胶水解生成聚半乳糖醛酸酶的一类酶的总称。

（ ✗ ）3、DNA聚合酶可以催化DNA小片段聚合生成大分子DNA。

（ ✓ ）4、青霉素酰化酶可以催化头孢霉素水解生成7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA）

五、简答题

1、举例说明酶在疾病诊断，疾病预防和治疗及药物制造方面的应用。

（一）、酶在疾病诊断中的应用

1、测定体内与疾病有关的某种酶的活力，利用该酶的活力变化作为诊断某种疾病及其病情严重程度的重要指标。

2、利用某种酶制剂作为分析试剂，测定体内与疾病有关的代谢物的浓度变化，利用该物质浓度的变化程度作为诊断某种疾病及其病情严重程度的重要指标。

（二）、酶在治疗疾病上的应用

1、药用酶的治疗作用

2、药用酶的种类

3、药用酶的新剂型及给药方式

4、载酶人造细胞

5、酶用于体外循环装置

2、酶在食品领域有哪些重要作用？举例说明。

（一）、酶在食品保鲜方面的应用

酶技术保鲜就是利用酶的催化作用，消除外界因素对食品产生的不良影响。

除氧保鲜: 葡萄糖氧化酶

C6H12O6+O2 C6H12O7+H2O2

脱糖保鲜:葡萄糖氧化酶

灭菌保鲜: 溶菌酶

（二）、酶在食品生产方面的应用

（三）、酶在食品添加剂生产方面的应用

（四）、酶在改善食品的品质和风味方面的应用

3、举例说明酶在轻工、化工生产中的应用。

（一）、酶在原料处理方面的应用

生物抛光是一种用纤维素酶改善纤维素纤维制品表面的整理工艺,以达到持久的抗起毛起球并增加织物的光洁度和柔软度

（二）、酶在轻工、化工产品生产方面的应用

（三）、加酶增强产品的使用效果

4、举例说明酶在环境保护方面的应用。

水净化：水与人类的生活息息相关，离开水的滋养，人类将不复存在，因此世界范围的水污问题是目前人类最关心的环境主题。水源污染常常是由那些剧毒，而且抗生物降解的化学品造成的，这些化合物很容易在体内组织中浓缩聚集，使人产生疾病。为了保护水资源及人类的健康，除去这些有毒的化合物以消除污染是至关重要的。实践证明，用酶处理这些污染物是行之有效的。早在20世纪七八十年代，固定化酶已被用于水和空气的净化。 利用固定化热带假丝酵母的复合酶系能够分解酚，可以用来处理含酚废水 最近日本国家资源和环境学院已成功应用酪氨酸酶、过氧化物酶和漆酶对废水中的有毒化合物进行了处理。

5、在原生质体制备方面主要应用哪几种酶？

细菌细胞壁的去除 如：溶菌酶

酵母细胞壁的去除如：β-葡萄糖酶、磷酸甘露糖

霉菌细胞壁的去除 如：几丁质酶、壳多糖

植物细胞壁的去除如：果胶酶、纤维素酶

六、综合分析题

简述溶菌酶的应用。

溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶。人们对溶菌酶的研究始于本世纪初，英国细菌学家弗莱明(Fleming)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入，发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类，还有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。近几年，人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。
溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前日本已生产出医用溶菌酶，其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。
溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。
目前实际应用的、业已商品化的是鸡蛋清溶菌酶。我国是采用蛋厂鸡蛋壳中残留的蛋清为原料生产的，为白色、无臭结晶粉末，味甜。近年来，人们正研究用微生物发酵法生产溶菌酶，同时还采用酶修饰法先后合成了溶菌酶-环糊精和溶菌酶一半乳甘露聚糖，经过修饰后的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能，应用于发酵饮料中防腐效果较好。此外，由于溶菌酶抗菌谱较窄，只对G+细菌起作用，为了加强其溶菌作用，人们常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用，以增强对G-细菌的溶菌作用，在食品防腐中效果显著。

测验（一）

一、 名词解释

一、 发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速度，产物形成速度、基质消耗速度以及环境因素对速度的影响；在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义

一、 亲和层析：利用生物分子与配基间所具有的专一而不可逆的亲和力使生物分子分离纯化的方法

一、 氨基酸置换修饰:将酶分子肽链上的某个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

一、 酶分子定向进化:是模拟自然进化过程中，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良的催化特性的突变体的过程。

药用酶：酶可以作为药物治疗多种疾病，作为药物用于预防和治疗疾病的酶。

二、填空题

1、酶活力是　　　　  　    的量度指标，酶的比活力是　　　　  　    的量度指标，酶转换数是　　　　  　    的量度指标。

2、固定化原生质体是固定在载体上并在一定的空间范围内进行　　　　  　    的原生质体。

3、膜反应器是将酶的与半透膜的组合在一起而成的反应器。

4、利用丙烯氰为原料，在　　　　  　    催化下，可以水合生成　　　　  　    。

5、定点突变是在DNA序列的进行碱基的改变，从而获得　　　　  　    的技术。

三、选择题

1、酶工程是（ C）的技术过程。

A、利用酶的催化作用将底物转化为产物

B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶。

C、酶的生产与应用

D、酶在工业上大规模应用

2、莫诺德常数是指（ B ）

A、反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

B、比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

C、产酶速率达到最大产酶速率一半时的限制性基质浓度。

D、细胞生长速率达到最大细胞生长速率一半时的限制性基质浓度。

3、端粒酶是（ C ）

A、催化端粒水解的酶

B、存在于端粒中的酶

C、催化端粒生成和延长的酶

D、催化RNA生成和延长的酶

4、超临界流体能够用于物质分离的主要原因在于（ ）

A、超临界流体的密度接近于液体

B、超临界流体的黏度接近于液体

C、在超临界流体中不同物质的溶解度不同

D、超临界流体的扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍

5、天苯肽是由（ A ）缩合而成。

A、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基

B、L-天冬氨酸的B-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基

C、L-天冬氨酸的氨基与L-苯丙氨酸的a-羧基

D、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸的氨基

四、问答题

1、举例说明动物细胞培养产酶的工艺流程。

将种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散成悬浮细胞；再将悬浮细胞前所未有入适宜的培养液中，在人工控制条件的反应器中进行细胞悬浮培养或者贴壁培养；培养完成后，收信培养液，分离纯化得到所需产物。

以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例说明动物细胞培养产酶的工艺过程及控制①人黑色素瘤细胞培养基②人黑色素瘤细胞培养③组织纤溶酶原活化剂的分离纯化

2、为什么SDS凝胶电泳会不受蛋白质分子所带电荷及分子形状的影响？

SDS能使蛋白质分子的氢键，疏水键打开，并与蛋白质分子结合，形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带负电荷，使各种蛋白质-SDS复合物带上相同密度的负电荷，而掩盖了不同蛋白质之间原来电荷的差别。此外SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化。为此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷及分子形状的影响，而只决定与蛋白质的相对分子质量

3、酶的非水相催化有哪些特点？

1，在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性发生改变。在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。

2，酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中。酶的立体选择性较差。

3，酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。

4，酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。即在同一个底物分子中有2种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一个化学键优先进行反应。

5，许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中热稳定性更好。决定了它的应用条件更为宽泛。

6，在有机介质中，酶所处的PH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液PH相同。

4、什么叫DNA重排技术？其主要过程包括哪些步骤？

用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心

重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪条技术路线；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的

测验（二）

一、 名词解释

酶的改性技术：是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等

酶的提取：指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解得到溶剂或溶液中的过程。

抗体酶：通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。

酶转换数：是酶活性的一种表示法，定义为代表单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。

肽链有限水解修饰：在肽链的有限位点进行水解，使酶的空间结构发生某些惊喜的改变，从而改变酶的催化特性的方法

二、填空题

1、锤头型核酸类酶含有　　　13　  　    个保守核苷酸残基和　　　　3  　    个螺旋结构域。

2、用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH　高　  　    ，用带正电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH　　　低　    ，用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH　一般不变 　    。

3、有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性　强　　  　    ，对酶活性的影响　　越大  　    。

4、青霉素酰化酶可以催化青霉素水解生成　　　　  　    和　　　　  　    。

5、插入B-半乳糖苷酶基因片段的噬菌体DNA，转染大肠杆菌细胞后，在含有诱导酶　B-半乳糖苷酶　   和底物X-gal的平板培养基上可以形成　　　　  　    细菌斑。

三、判断题

（ √ ）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。

（ √2、有机磷农药是胆碱酯酶的一种抑制剂，可以通过检测胆碱酯酶的活性变化，来判断是否受到有机磷酸农药的污染。

（√ ）3、通过改变酶分子的空间构象而改变酶的催化特性的修饰方法称为物理修饰法。

（× ）4、延胡索酸是催化延胡索酸水合反应的酶。

（× ）5、氨酰-tRNA合成酶具有识别mRNA和tRNA的功能。

四、问答题

1、何谓分解代谢物阻遏作用？有哪些方法可以解除分解代谢物阻遏作用？

：分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引起的阻遏作用。

例：枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成受到其反应产物无机磷酸的阻遏，当培养基中无机磷酸的含量超过1mmol/L的时候，该酶的生物合成完全受到阻遏。当培养基中无机磷酸的含量降低到0.01mmol/L的时候，阻遏解除，该酶大量合成。

为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。可以采用其他较难利用的碳源，如淀粉等，或者采用补料，分次流加碳源等方法。控制碳源的浓度在较底的水平，以利于酶产量的提高。

2、试述酶活力测定的基本步骤。

（1）配制底物溶液

（2）确定反应条件

（3）反应开始，记时间

（4）测定产物的生产量或底物的减少量

3、有机溶剂对催化有何要求？

4、选择酶反应器的主要依据有哪些？

主要根据酶的应用形式、反应动力学性质、底物或产物的理化性质进行选择。

①据酶的应用形式选择反应器。

②据酶反应动力学选择反应器

③根据底物或产物的理化性质选择反应器

④应用的可塑性及成本

⑤酶的稳定性

5、试分析固定化细胞与固定原生质体有哪些异同点？

重点在课时多的地方，简答题只要答出点就可以了，不需要详细，（七八张非重点，稍微看下，不会出简答，老师说的）

酶工程习题（答案全）