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发布时间:2023-11-13 23:41:49
细胞转染技术原理及应用>>>>常规转染技术分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:>>>>转染方法原理应用特点不适用于原代细胞磷酸钙DNA复合物吸附稳定转染磷酸钙法操作简便但重复性差细胞膜被细胞内吞瞬时性转染有些细胞不适用带正电的DEAE-右旋糖相对简便、结果可重复DEAE-右旋糖苷苷与核酸带负电的磷酸瞬时性转染但对细胞有一定的毒副作用法骨架相互作用形成的复转染时需除血清合物被细胞内吞高脉冲电压破坏细胞膜稳定转染适用性广但细胞致死率高,DNA和电穿孔法电位,DNA通过膜上形成瞬时性转染细胞用量大,需根据不同细胞类的小孔导入所有细胞型优化电穿孔实验条件通过侵染宿主细胞将外可用于难转染的细胞、原代细胞,病毒介导法稳定转染源基因整合到染色体中体内细胞等但携带基因不能太大细胞需处分特定宿主细逆转录病毒裂期胞需考虑安全因素瞬时转染通过侵染宿主细胞将外可用于难转染的细胞腺病毒特定宿主细源基因整合到染色体中需考虑安全因素胞带正电的脂质体与核酸稳定转染适用性广,转染效率高,重复性好,阳离子脂质体带负电的磷酸基团形成瞬时性转染但转染时需除血清。转染效果随细法复合物被细胞内吞所有细胞胞类型变化大将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的Biolistic颗粒可用于:人的表皮细胞,纤维原细颗粒用弹道装置投射入瞬时性转染传递法胞,淋巴细胞系以及原代细胞细胞,DNA在胞内逐步释放,表达用显微操作将DNA直接稳定转染转染细胞数有限,多用于工程改造显微注射法注入靶细胞核瞬时性转染或转基因动物的胚胎细胞第1页共6页
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