实验七 紫外吸收法测蛋白质浓度

姓名：周超

同组者：刘炳煜

班级：11级生命基地

学号：201100140067

【实验目的】

1、 了解紫外吸收法测蛋白质浓度的原理

2、 熟悉紫外分光光度计的使用

【实验原理】

蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。

由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核算时必须同时测定280nm及260nm的吸光值，方可通过计算测得溶液中的蛋白质弄浓度。

【实验材料】

一、器材

UV-9100型紫外分光光度计

试管7个

移液管

摇匀器

洗瓶

二、试剂

标准酪蛋白 1mg/ml

样品血清（稀释100倍）

蒸馏水

【实验步骤】

一、直接测定法

1、在紫外分光光度计上，将样品血清溶液小心盛于石英比色皿中，以水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）

2、当A280nm/A260nm﹤1.5时，将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度：

C=1.45 A280nm- 0.74A260nm

式中 C：蛋白质质量浓度（mg/ml）

3、当A280nm/A260nm﹥1.5时，将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度：

血清蛋白质量浓度（mg/ml）=（A280nm/6.3）×10

二、标准曲线法

取7支试管，按下表加入试剂。

加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，对1-7号作图，测样品管的A280nm，对照标准曲线求得蛋白质浓度。

【实验结果】

一、直接测定法

1、C=（1.45 A280nm- 0.74A260nm）*2*100=72.4mg/ml

2、C=[（A280nm/6.3）*10]*2*100=128.0 mg/ml

二、标准曲线法

C=0.403/0.8424*2*100=95.6mg/ml

【结果分析】

三种计算测定和计算方法得出三个数值：

使用公式C=（A280nm/6.3）*10计算得到的数值准确性最差，因为实验数据不满足该公式的使用条件A280nm/ A260nm〉1.5。

使用公式C=1.45 A280nm- 0.74A260nm计算得到的数值准确性最高，因为实验数据满足该公式的使用条件A280nm/ A260nm〈1.5，同时，还消除了核酸对实验数据的影响。

使用标准曲线法得到的数值较使用公式C=1.45 A280nm- 0.74A260nm计算得到的数值准确性稍差，标准曲线法仅使用了A280nm的数据，但因为核酸在280nm波长处也有光吸收，会对实验结果造成干扰，造成结果偏大。

【思考讨论】

1、紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法的优缺点：

优点：简单、灵敏、快速、高选择性。不消耗样品，测定后仍能回收使用；低浓度的盐和大多数缓冲液都不干扰测定，适合柱层析洗脱液的快速连续检测。

缺点：仪器昂贵，不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差。准确度较差，干扰物质多；在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪蛋白和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差；样品中若含有嘌呤、嘧啶及核算等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰；测定时受样品的PH影响较大。

2、 直接测定法与标准曲线法比较

直接测定法：操作简单，快捷方便，不消耗样品，样品扔能回收利用；可以有效消除核酸的干扰，实验结果较准确，它还适用于硫酸铵或其他盐类物质混杂的情况。但是不同蛋白质及核酸的光吸收率不完全相同，还是会产生些许误差。

标准曲线法：简单常用，但是实验结果准确性较差，干扰因素多，比如酪蛋白和色氨酸含量的差异、嘌呤、嘧啶及核算等都会对实验结果造成干扰。

2、注意事项:

（1）制作标准曲线时，加样一定要准确。

（2）测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。

（3）注意直接测定法中公式的使用条件。

山大生化实验报告 实验七 紫外吸收法测蛋白质浓度