实验一 药物急性半数致死量（LD50）的测定

【目的】

了解药物半数致死量(LD50)测定的意义、原理，掌握半数致死量的测定方法和计算过程。

【原理】

LD50是指在一群动物中能使半数动物死亡的剂量。由于实验动物的抽样误差，药物的致死量对数值大多在50％质反应的上下呈正态分布。在这样的质反应中药物剂量和质反应间呈S型曲线，S型曲线的两端处较平，而在50％质反应处曲线斜率最大，因此这里的药物剂量稍有变动，则动物的死或活的反应出现明显差异，所以测定半数致死量能比较准确地反映药物毒性的大小。

【实验材料】

1、 动物：小白鼠，体重18-24g，雌、雄各半，实验前禁食12小时，不禁水。

2、 药品：盐酸普鲁卡因，苦味酸。

3、 器械：小鼠笼，天平，注射器（1mL），电子计算器。

【方法和步骤】

（一）预备实验

1、探索剂量范围： 先找出100%及0%死亡的剂量，此即上下限剂量（Dm及Dn）。方法是先取出小鼠9-12只，每组3只，按估计量（根据经验或文献资料定出）给药，如3只小鼠全死则降低剂量一半，如全不死则增加剂量一倍，如部分死亡，则按2：1的比例向上、向下调整剂量，由此找出上下限剂量。

2、确定组数，计算各组剂量：

确定组数（G）：可根据适宜的组距确定组数，一般分5-8个剂量组。

计算各组剂量：要求各组剂量按等比级数排列，在找出Dm及Dn和确定组数后，可按下列公式求出公比r：

r =

再按公比计算各组剂量D1,D2,D3,D4,D5……Dm，其中D1=Dn=最小剂量，D2=D1r; D3=D2r; D4=D3r; D5=D4r; ……DG=DG-1r。r值一般以1.7~1.15之间为宜。

计算举例：已知某药在致死毒性实验中，Dm=187.5 mg/kg; Dn=76.8 mg/kg, 确定组数G=5，求r及各组剂量。先代入公式求r=1.25，再计算各组剂量D1=Dn=76.8 mg/kg, D2=76.81.25=96 mg/kg, 依次计算D3，D4，及DG(D5)分别为120，150，187.5 mg/kg。

3、配制等比稀释药液系列，使每只小鼠给药容量相等，一般为0.1-0.25 mL/10g。母液浓度C= Dm/等容注射量，如某药的Dm=187.5 mg/kg，等容注射量为0.2 mL/10g，则母液浓度C=187.5（mg/kg）/0.2（mL/10g）=0.94%。按此配制母液25mL放入5号小烧杯，即为5号液；从中吸出20 mL 放入4号小烧杯，加水至25mL，即为4号液；再吸出20mL 4号液放入3号杯中，加水至25mL，即为3号液，如此类推，配制出2号液和1号液。

（二）正式实验

1、分组编号：称各小鼠体重，将体重相同小鼠放一笼，分别用苦味酸做好标记。再按确定组数（5组）分层随机分组，使各组平均体重及性别分布尽可能一致，每组一般用小鼠10只（5只雄性，5只雌性）。

1、给药：先计算各体重组小鼠腹腔等容注射药量（0.2mL/10g），取相应的等比稀释药液，给各组小鼠腹腔注射。给药顺序：如分为5组，先按2、3、4组顺序给药，再根据实验结果决定是向下或向上注射。

2、观察记录：给药后观察小鼠中毒表现，记录小鼠死亡数，计算每组死亡率。观察时间可根据药物作用快慢而定，应到小鼠不再因药物作用死亡为止。一般观察时间为24小时，作用快者可观察10—30分钟。本次实验观察时间为30分钟，记录每组剂量和动物死亡数。

【计算LD50及95%可信限】

1、 孙氏改进寇氏法

（1） 基本要求

1) 反应情况符合活接近对数正态分布。

2) 相邻两剂量的比值应相等。

3) 各组动物数相等或相近，一般为10只。

4) 不要求死亡率必须包括0％与100％，但二者之和最好在80％－120％范围内。

（2） 计算公式

1）当最小剂量组的死亡率为0％，最大剂量组的死亡率为100％时，按下列公式计算：

式中Xm―最大剂量的对数；

p―各组动物的死亡率（以小数表示）

∑p―各组动物死亡率的总和（p1+p2+p3……）

I―相邻两组对数剂量的差值（大剂量组减小剂量组）。

2）当最小剂量组的死亡率大于0％而又小于30％，或最大剂量组的死亡率小于100％而又大于70％时，可按下列校正公式计算：

式中Pm―最大剂量组的死亡率；

Pn―最小剂量组的死亡率。

3）LD50的标准误按下列计算：

式中 n―每组的动物数。

4）LD50的95％可信区间按下式计算：

Lg-1(lgLD50±1.96SlgLD50)

2、应用计算软件：点击桌面“LD50”进入计算软件，将各组剂量和死亡数填入，然后点击“运行”，即可算出LD50及95％可信限。

【注意事项】

1、本实验为定量药物效价测定，要求较高的准确性，在实验过程中要求实验者做到准确无误。

2、动物种类、体重范围、给药途径、实验观察时间等因素对LD50及ED50的测定结果都有影响，在报告结果时都应加以注明。

3、公比的表示法有2种：（1） r=D2/D1； （2） K=D1/D2。二者的关系为r=1/K，D2=D1 r 或D2=D1/K。如r=1.25则K=1/1.25=0.8。

实验二 最大耐受量（MTD）测定

【目的】

了解最大耐受量的概念，掌握其测定方法。

【原理】

最大耐受量（MTD）是指动物能够耐受而不引起动物产生死亡的最高剂量。当某些药物用最大允许浓度和最大允许容量给予动物时仍未能测出LD50，可以做一次或一日最大耐受量测定，也可反映受试药的毒性情况。

【实验材料】

1器材 小鼠灌胃针头，烧杯，天平。

2药物 某种中药浸膏。

3动物 小鼠（20±2g，雌雄各半）。

【方法和步骤】

取禁食12～16h的小鼠20只，雌雄各半，按药物最大允许浓度和小鼠最大允许容量给小鼠灌胃给药1次，连续观察7天，记录小鼠给药后外观、行为、饮食、分泌物、排泄物等的变化。

【结果与处理】

若7天内未见任何动物死亡，则MTD可写成大于××g／kg剂量。

【注意事项】

小鼠灌胃最大给药剂量为0.4mL／10g，最多不超过1.0mL／只，给药浓度根据药物的理化性质，以能顺利通过灌胃器针头为度。当注射给药尤其是静脉注射时，一般还要求pH和渗透压在可忍受范围之内，注射速度控制在10～20s。

药物急性毒性实验