X射线晶体衍射分析

【摘要】：本文介绍了晶体衍射分析的原理并对X射线在晶体衍射中的应用及具体分析步骤进行了阐述。X射线晶体衍射分析能解析蛋白质晶体中原子在空间的位置与排列，迄今仍然是蛋白质和核酸三维结构测定的最主要方法，是精确测定蛋白质分子中每个原子在三维空间位置的工具。

【关键词】：X射线 晶体 衍射

1. 引言

任何物质均由原子离子或分子组成。晶体有别于非晶物质，它的内部所含原子离子或分子具有严格的三维有规则的周期性排列。可以从晶体中取出一个基本单元，称为之晶胞。晶体的周期性结构使晶体能对X射线中子流电子流等产生衍射效应，形成X射线衍射法.中子流衍射法.电子流衍射法。这些衍射法能获得有关晶体结构可靠而精确的数据，其中最重要的是X射线晶体衍射法。1912年劳厄（M.von Laue）首先发现X射线可以被晶体衍射，开创了晶体结构分析的X射线衍射法。此后不久英国物理学家布拉格父子（W.H.Bragg和W.L.Bragg）在劳厄实验的基础上，导出了一个比较直观的X射线衍射方程式，从而为X射线衍射理论和技术的发展奠定了坚实的基础。X射线晶体衍射分析能解析蛋白质晶体中原子在空间的位置与排列，迄今仍然是蛋白质和核酸三维结构测定的最主要方法，是精确测定蛋白质分子中每个原子在三维空间位置的工具。

2. X射线晶体衍射分析的发展史

2.1 蛋白质晶体的第一个X射线图像时Bernal和Crowfoot于1934年测定的，他们发现蛋白质分子含有丰富的结构信息。

2.2 1954年由Perrtz等人证明重原子同晶置换（heavy atom isomorphous replacement）可以解决相应的问题，又经Blow和Crick加以发展，才解析了蛋白质的晶体结构。

2.3 在1957年和1959年Kerdrew和Perutz分别获得了肌红蛋白和血红蛋白的低分辨率（0.6nm和0.5nm）结构。

2.4 在1957~1967年的10年里，溶菌酶、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶也分别获得了高分辨率的晶体结构。

2.5 从20世纪60年代末进入70年代，X射线晶体衍射分析从对生物大分子三维结构测定进入生物大分子三维结构及其生物学功能之间关系的研究。

2.6 现在，生物大分子晶体学已被应用到测定由许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装体的晶体结构。

3. X射线衍射分析原理

3.1 X射线的产生

1912年劳埃等人根据理论预见，并用实验证实了X射线与晶体相遇时能发生衍射现象，证明了X射线具有电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个里程碑。

3.2 X射线晶体衍射分析的理论依据

X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。将具有一定波长的X射线照射到结晶性物质上时，X射线因在结晶内遇到规则排列的原子或离子而发生散射，散射的X射线在某些方向上相位得到加强，从而显示与结晶结构相对应的特有的衍射现象。衍射X射线满足布拉格（W.L.Bragg）方程：2d sinθ=nλ式中：λ是X射线的波长；θ是衍射角；d是结晶面间隔；n是整数。波长λ可用已知的X射线衍射角测定，进而求得面间隔，即结晶内原子或离子的规则排列状态。将求出的衍射X射线强度和面间隔与已知的表对照，即可确定试样结晶的物质结构，此即定性分析。从衍射X射线强度的比较，可进行定量分析。本法的特点在于可以获得元素存在

的化合物状态、原子间相互结合的方式，从而可进行价态分析，可用于对环境固体污染物的物相鉴定，如大气颗粒物中的风沙和土壤成分、工业排放的金属及其化合物（粉尘）、汽车排气中卤化铅的组成、水体沉积物或悬浮物中金属存在的状态等等。

4. X射线晶体衍射分析步骤

X 射线晶体衍射分析主要包括以下几个步骤：

4.1 蛋白质单晶的制备

制备蛋白质单晶常用气相扩散法和平衡透析法气相扩散法。前者是蛋白质晶中使用的标准方法，小体积比较合适，容易建立且易于监测反应进度。通常的做法是“悬滴”，即在蛋白质溶液中加入浓度不足以沉淀蛋白质的“沉淀剂”。悬滴于一个大的含有沉淀剂的储液槽相对，当把储液槽封闭后，平衡时悬滴液内的蛋白质倾向于过饱和浓度，从而引发悬滴液内的蛋白质结晶。而平衡透析法，在具有高或低离子强度的蛋白质结晶中使用。在容器中用半透膜隔开小体积的蛋白质溶液和沉淀剂，沉淀剂慢慢促使隔间中的蛋白质溶液形成晶体。

结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的难点。

4.2 衍射数据收集和处理

衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接关系到结果的精度。好的衍射数据于晶体的好坏、X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。

蛋白质晶体暴露于空气中将解体，因为晶体中含水量相当高（20%~70%），在收集数据前要将晶体密封于一种特殊的毛细管中。现在常使用低温冷冻晶体的方法来收集数据，蛋白质晶体快速冷冻鱼液氮中，其结构不受影响，且蛋白质分子的热运动降低，可以提供分辨率。

对X射线衍射数据的收集和记录装置有两大类：一类是使用对X射线敏感的照相底片或图像板，另一类是计数管或面探测仪。他们都具有一定的自动化程度，但为了满足结构基因组学研究的要求，还有待发展衍射数据收集的全自动化装置。

4.3 相位确定和改进

相位确定是X射线晶体结构分析的核心。最基本的方法是同晶置换法，这是用于未知结构分析的最有效方法，另外还有分子置换法、差值电子密度法，以及目前发展很快的多波长反常散射法。

晶胞的大小和形状决定了晶体的衍射方向，反过来，通过衍射点的位置可以推算出晶胞参数和空间群，这叫做初步晶体学参数的测定。但晶胞中的原子种类以及它在晶胞中的分布位置决定了衍射线强度，反过来，通过衍射线强度和一些方法，可以了解相位信息，从而通过富里哀加和获得电子密度函数，获得原子在晶胞中的分布位置，这就是晶体结构测定的目的和结果。

由电子密度函数确定的电子密度图得质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。在某些情况下采用晶胞不对称单元中等同部分的电子密度平均，有可能大大改善误差较大的起始相角。

4.4 电子密度图的诠释

已知衍射线的结构振幅（强度）和相位，通过富里哀加和就可能计算电子密度图。电子密度图时晶体结构分析的直接结果，它包含了结构的全部信息，如何从一套电子密度图分析出这些信息，尚有一系列问题需要解决。因为实验每一步都有误差，最后所有的误差都会表现在电子密度图上，在解释电子密度图之前有一些方法和原则改善电子密度图，称为电子密度图的修饰。如溶剂平滑法（solvent flattering）、网格图修饰法（histogram）。

4.5 结构模型精化

通过电子密度图分析获得的结构模型，还需要进行原子坐标的精化，结构精化主要使用的是限制性最小二乘修正。目前已经有一些全自动化的分析软件用于结构修正，如：PROLSQ、XPLOR、TNT、CNS、BUSTER、REFMAC等。最后用实体模型或模型显示系统将蛋白质空间结构显示出来。

5. X射线在晶体衍射分析中的应用

X射线在结构分析中应用非常广泛，现已渗透到物理、化学、矿物学、冶金学、地球科学和生命科学以及各种工程技术科学之内，成为一种重要的手段和分析方法，提供系统的结构信息。

5.1 物相分析

衍射图

晶体的Ｘ射线衍射图像实质上是晶体微观结构的一种精细复杂的变换，每种晶体的结构与其Ｘ射线衍射图之间都有着一一对应的关系，其特征X射线衍射图谱不会因为它种物质混聚在一起而产生变化，这就是Ｘ射线衍射物相分析方法的依据。制备各种标准单相物质的衍射花样并使之规范化，将待分析物质的衍射花样与之对照，从而确定物质的组成相，就成为物相定性分析的基本方法。鉴定出各个相后，根据各相花样的强度正比于改组分存在的量（需要做吸收校正者除外），就可对各种组分进行定量分析。目前常用衍射仪法得到衍射图谱，用“粉末衍射标准联合会（JCPDS）”负责编辑出版的“粉末衍射卡片（PDF卡片）”进行物相分析。

5.2 点阵常数的精确测定

点阵常数是晶体物质的基本结构参数，测定点阵常数在研究固态相变、确定固溶体类型、测定固溶体溶解度曲线、测定热膨胀系数等方面都得到了应用。点阵常数的测定是通过X射线衍射线的位置（θ ）的测定而获得的，通过测定衍射花样中每一条衍射线的位置均可得出一个点阵常数值。

5.3 应力的测定

X射线测定应力以衍射花样特征的变化作为应变的量度。宏观应力均匀分布在物体中较大范围内，产生的均匀应变表现为该范围内方向相同的各晶粒中同名晶面间距变化相同，导致衍射线向某方向位移，这就是X射线测量宏观应力的基础；微观应力在各晶粒间甚至一个晶粒内各部分间彼此不同，产生的不均匀应变表现为某些区域晶面间距增加、某些区域晶面间距减少，结果使衍射线向不同方向位移，使其衍射线漫散宽化，这是X射线测量微观应力的基础。超微观应力在应变区内使原子偏离平衡位置，导致衍射线强度减弱，故可以通过X射线强度的变化测定超微观应力。测定应力一般用衍射仪法。

5.4 晶粒尺寸和点阵畸变的测定

若多晶材料的晶粒无畸变、足够大，理论上其粉末衍射花样的谱线应特别锋利，但在实际实验中，这种谱线无法看到。这是因为仪器因素和物理因素等的综合影响，使纯衍射谱线增宽了。纯谱线的形状和宽度由试样的平均晶粒尺寸、尺寸分布以及晶体点阵中的主要缺陷决定，故对线形作适当分析，原则上可以得到上述影响因素的性质和尺度等方面的信息。主要方法有傅里叶法、线形方差法和积分宽度法。

5.5 单晶取向和多晶织构测定

单晶取向的测定就是找出晶体样品中晶体学取向与样品外坐标系的位向关系。虽然可以用光学方法等物理方法确定单晶取向，但X衍射法不仅可以精确地单晶定向，同时还能得到晶体内部微观结构的信息。一般用劳埃法单晶定向，其根据是底片上劳埃斑点转换的极射赤面投影与样品外坐标轴的极射赤面投影之间的位置关系。透射劳埃法只适用于厚度小且吸收系数小的样品；背射劳埃法就无需特别制备样品，样品厚度大小等也不受限制，因而多用此方法 。

多晶材料中晶粒取向沿一定方位偏聚的现象称为织构，常见的织构有丝织构和板织构两种类型。为反映织构的概貌和确定织构指数，有三种方法描述织构：极图、反极图和三维取向函数，这三种方法适用于不同的情况。对于丝织构，要知道其极图形式，只要求出求其丝轴指数即可，照相法和衍射仪法是可用的方法。板织构的极点分布比较复杂，需要两个指数来表示，且多用衍射仪进行测定 。

6．X射线晶体衍射分析的发展

近些年，蛋白质X射线晶体学无论从结构测定的方法，还是从结构测定所用的仪器上都有了飞跃的发展。可变波长的同步辐射加速器的应用使高分辨率、高质量的衍射数据的获得变得较为容易。低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋白质晶体在衍射过程中所受的辐射损害大为减少，从而减低了对晶体的要求并提高了数据质量。各种形式的面探测器和CCD的出现大幅度提高了数据收集速度和精度。而各种计算机硬件和软件的发展更为晶体学的发展提供了强有力到了计算工具。如今，在相当程度上，蛋白质晶体学已成为一种常规的技术手段，它可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构。

另外，X射线晶体衍射结构分析正努力在第四维时间坐标上跟踪、分辨和描述生物大分子的结构变化，即所谓四维晶体结构的测定。由于同步辐射所提供的X射线光源可以达到很高强度，因而可以在一秒计的时间范围收集一套完整的衍射数据，使得在以秒计的时间范围内的结构动态测定成为可能。

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