成绩：

2010～2011 学年第二学期硕士研究生

《糖品分析与检测》大作业（100分）

专业 微生物 学号 姓名

1．叙述糖品分析与检测的重要性、必要性与可行性（5分）。

（1） 糖品是人类生活必不可少的成分

糖品是食品添加剂的主要组成部分，所以在食品加工过程中对它的质量控制很关键。

（2）很多糖品具有生理活性

随着人们健康意识的提高，功能性食品方兴未艾。功能性食品中真正起作用的是生理活性物质，活性多糖、功能性单糖、功能性低聚糖及多元糖醇都具有生理活性。

（3） 功能性食品的分析已势在必行

功能性食品中活性成分的定性、定量分析是功能性食品生产和管理的重要环节，同时对我国的功能性食品走向科学化、系列化、标准化和国际化能够起到积极的促进作用。

2．结合所开设的实验（至少3个实验）叙述该方法的原理，操作要点，实验数据的处理，结果与讨论，误差产生的可能原因及避免方法和措施（每个方法20分，共60分）。你个人的建设性的见解（5分）。

i. 薄层层析法分离分析苦参豆子中生物碱各组分并进性定性分析

实验原理：苦豆子总生物碱经甲醇溶解，，然后将其用毛细管点样于表面涂有均匀薄层的硅胶玻璃板的一端，经展开槽中展开剂展开后,使各种对吸附剂亲合力不同和对展开剂溶解度不同的组分在反复吸附、解吸的过程中得到分离。对吸附剂亲合力弱及对展开剂溶解度大的组分移动速度较快；相反则移动速度较慢。根据各组分在板上的比移值与标准样的比移值比较，进行定性分析。

操作要点：样品制备，苦豆子经4%NaOH浸泡24h后，4倍体积乙醇浸泡6h、过滤，浓缩脱除乙醇得总生物碱；用甲醇溶解即得到样品液。硅胶板活化，硅胶G 板经 105℃烘１～２小时，然后置入干燥器中冷却、保存。展开剂制备，氯仿:甲醇:浓氨水（V/V）=7:3:0.1的比例配制，备用。显色剂：配制碘化铋钾试剂，Ⅰ：0.85g硝酸铋溶于10ml冰醋酸及40ml蒸馏水中；Ⅱ：8.0g碘化钾溶于20ml蒸馏水中；取Ⅰ和Ⅱ液各1ml与2ml冰醋酸及10ml水混匀。将显色剂装入棕色试剂瓶中，备用。点样，基准线定位——在硅胶板上画出基准线和前沿线。基准线以板下部向上１厘米处画一水平线，在展距8厘米处再画一水平线作为前沿线。 在基准线的两端 0.6～1 厘米处定位，在定位的两端点间按 0.6～1 厘米的距离分成若干个点，作为样品与标准样的点样位置，并标注样品号码和标准样的位置。毛细管准备，取10μl或20μl毛细管，或用玻璃细管拉成尖端约 0.1毫米的毛细管，尖端用砂纸磨光（以免损坏硅胶板）。用毛细管吸取样品液，拭净管外样液；在硅胶板上预定的位置上点样，样少时一次点下，样多时分次点下；一面点样一面用吹风机吹干，使样点的直径＜２毫米。注意不要点穿硅胶板。最后，在板的标准样位置点上标准样。展开： (1) 将展开槽水平放置，槽内装入展开剂大约 0.5厘米高，盖上槽盖，静置一会儿，使槽内被展开剂蒸汽饱和。 (2) 将点好样的硅胶板置入槽内，并使基准线在下方水平放置。经过一段时间后，展开剂便沿板由下向上平移，当移至板前沿线时取出，吹干。显色：将板浸入装有碘化铋钾试剂烧杯中，快速取出并用电吹风吹干，样点与标准点的位置便显现出来。计算比移值。

数据处理：将走板结果画在实验报告纸上，计算各斑点的比移值。

结果讨论：通过计算比移值，可对样品中的组分进行定性分析；若毛细管的容积为确定时，也可以进行半定量分析。

ii. 紫外分光光度法测样品中的苦味质

实验原理：苦味质的主要成分是异α-酸。通过使用异辛烷萃取苦味质，以紫外分光光度计在275nm波长下用1cm的比色皿测定其吸光度，用以测定其相对含量。

操作要点：吸取10mL以除气温度在20℃左右的啤酒（不能损失泡沫）至50mL离心管中，并加入1mL 3N的盐酸溶液和20mL异辛烷，再加入2-3个玻璃球，拧上带有聚丙烯塞得盖。在电动振荡机上振荡15min（应呈乳状），然后移到离心机上以3000转∕分离心15min，使其分层。取离心后的上清液，置于1cm石英比色皿中，在波长为275nm处，以异辛烷作空白，测其吸光度。

数据处理：每个样品按方法各做两个平行样，同时加入样品、振荡、离心、比色，以避免因实验条件不同而产生的误差。苦味质=吸光度╳50（单位）

结果讨论：方法是在15-20℃条件下以手摇除气的方式处理啤酒样品，但不损失泡沫并使样品温度保持20℃左右。在误差允许的范围以内。此方法可以准确地测量出啤酒样本中苦味质上的含量。

误差来源:在操作工程中，可能除气的不充分会导致实验有误差产生。另外在萃取环节中，会有苦味质的损失，所以势必会造成一定的误差。

个人见解：啤酒的除气在是严重影响重大，在一般的条件下，可以手动除气，但是耗时颇多，而且容易损失泡沫。在具体的操作中，可以试试化学的方法，比如添加一些盐酸，使啤酒中酸根离子浓度增大，自然CO2的溶解度会降低很多，使得在后续的实验中，不会产生更大的误差。

iii. 凯氏定氮法测定样品中蛋白质含量

实验原理：利用硫酸及样品共热使蛋白质分解，其中的C、H形成CO2和H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在溶液中，将消化液碱化、蒸馏、使氨游离，随水蒸气一起蒸出被硼酸溶液吸收，用盐酸标准溶液滴定，根据盐酸标准溶液消耗量计算出总氮量，再乘以适当的换算系数换算为蛋白质量。

操作要点：（1）样品消化与蒸馏：精密称取混合均匀的样品1.5~2.0g，小心移入消化瓶中，再向消化瓶中加入4g混合剂（CuSO4：K2SO4=1：3）和20mL浓H2SO4，装入消化瓶中；将冷凝水打开，然后用弱火缓慢加热，待内容物完全炭化，泡沫消失后加大火力，消化至透明的蓝绿色，继续加热半小时，关闭火源，冷却至室温。得到初始消化液。将初始消化液移入100mL容量瓶中（容量瓶中事先加入10mL左右的蒸馏水），再用蒸馏水洗涤消化瓶数次，洗液并入容量瓶中，冷却至室温。冷却后用蒸馏水定容，摇匀，得到消化液，备用。用改良式微量凯氏定氮仪加热蒸馏，待第一滴蒸馏液滴下时开始计时，继续蒸馏5min，然后将锥形瓶放低，使出气管离开液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗出气管下端外壁，取下锥形瓶，洗涤蒸馏器，准备第二次蒸馏。（2）滴定：用0.01mol∕L的HCl标准溶液滴定锥形瓶内液体至灰白色为止，记录消耗HCl的量，再取样品消化液重新蒸馏滴定一次。（3）空白试验：取与消耗样品时相同的量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按同法进行消化、定容到100mL，得空白消化液，取同量空白消化液进行蒸馏、滴定、得出空白消耗0.01mol∕L的HCl标准溶液量。

数据处理：蛋白质%=【(V1-V0)╳N╳0.014╳F】∕【W╳V2∕100】╳100

式中：V0—─滴定空白蒸馏液消耗标准盐酸体积，mL；

V1──滴定样品蒸馏液消耗标准盐酸体积，mL；

V2──蒸馏时取的消耗液体积，mL；

N──标准盐酸溶液当量浓度；

0.014──氮的毫克当量；

F──蛋白质换算系数，麦芽粉F=6.25；

W──样品质量，g。

误差来源: 水蒸气发生器内的水要保持酸性以防止水中含的氮蒸馏出来，影响测定结果；洗涤微量凯氏定氮仪时，水不宜开得太大，进入蒸汽发生器内的水液面不要超过y形管以免进入蒸馏室，又使之污染。

个人见解：蒸馏过程中，在漏斗中加少量水密封，可以防止漏气；蒸馏时样品室内溶液会变成深蓝色或褐色这是正常现象，如不变色说明加碱量不足，应增加40%NaOH用量。

3．上网了解糖品分析与检测的目前现状与发展趋势（10分）。

A. 糖品分析与检测的目前现状：

糖品分析检测技术的种类很多，目前概括起来主要包括感官检验法、物理检验法（如比重法、折光法和旋光法等）和化学分析法（定性和定量）、色谱法等。

（1） 感官检验法

用感觉、视觉、嗅觉、触觉对糖品的质量进行检验和评价的方法。它具有快速和无需专门的仪器设备等特点，但存在着一定的主观性。

（2） 化学分析法

包括定性分析和定量分析。定量分析包括容量分析法和重量分析法。

（3） 仪器分析法

利用物质的物理性质或物理化学性质，借助于光电仪器测定其物理常数而得到其成分含量的分析方法。如：

折光法——测定物质的比重；

旋光法——测定样品的糖度、淀粉等；

（4）色谱法

色谱法包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱和超临界流体色谱等，以及它们与质谱的联用技术。

① 薄层色谱法——是在柱色谱和纸色谱的基础上发展起来的分离分析方法。

优点：设备简单、操作容易、对混合组分的分离效果好，所以广泛应用于生理活性物质的分离分析中。其基本过程包括：制板、点样、展开、显色和定性、定量分析等步骤。

缺点：重现性差，需标准品作对照。

② 气相色谱法——分离分析气体样品或高温下能够气化的样品。

优点：分离分析灵敏度高、稳定性好。

缺点：仪器昂贵，样品前处理复杂，操作人员需经严格的培训。

③ 高效液相色谱法——分离分析高沸点、不能气化或热稳定性差的的样品。

优缺点与气相色谱同。

（5）光谱法

根据待测物质的光学特性（如对光的吸收和发射特性），借助相应的检测仪器来实现分析的方法。常用的光谱分析方法：可见光分光光度法、紫外分光光度法等。

B. 发展趋势：随着世界经济的全球化，功能性食品跨国界和跨地区的流通越来越频繁，所以糖品分析与检测对检测速度要求越来越高；同时也对检测方法的灵敏度要求也越来越高，即最低检测限；此外对检测方法的特异性要求越来越高，即检测方法的抗杂质干扰能力； 还有一次实验同时分析多种成分； 检测方法的操作更为简便和容易掌握以及检测方法的“无试剂化”以及分析仪器的微型化和便携化。

4．结合所学知识，设计一个与糖品相关的研究性实验。叙述其实验目的、实验原理、实验所需仪器及试剂、实验的技术路线及可行性方案（20）。

高效液相色谱法分离分析糖类物质

一. 实验目的

1． 了解高效液相色谱仪分离分析糖类的基本原理；

2． 学会恒流洗脱的基本方法。

二. 实验原理

利用混合物中各组分的化学、物理性质差异，使各组分以不同程度分布在两相中。当流动相流过含有样品的固定相时，各组分以不同速度移动，从而达到互相分离的目的。

蒸发光散射检测器工作原理：

　　雾化：液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转变成细小的液滴，从而使溶剂更易于蒸发。液滴的大小和均匀性是保证检测器的灵敏度和重复性的重要因素。

　　蒸发：载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。在漂移管中，溶剂被除去，留下微粒或纯溶质的小滴。蒸发光散射检测器采用低温蒸发模式，维持了颗粒的均匀性。对半挥发性物质和热敏性化合物同样具有较好的灵敏度。

　　检测：光源采用激光，溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测池，并穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管进行收集。溶质颗粒在进入光检测池时被辅助载气所包封，避免溶质在检测池内的分散和沉淀在壁上，极大增强了检测灵敏度并极大地降低了检测池表面的污染。

三. 试剂

（1） 色谱纯乙腈：0.22μm微孔滤膜过滤，超声波除气；

（2） 超纯水：0.22μm微孔滤膜过滤，超声波除气；

（3） 标准品：分别将1mg/ml的葡萄糖、果糖、蔗糖等经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样。然后，再将1mg/ml的葡萄糖、果糖、蔗糖等量混合后，进样；

（4） 糖样品：将糖样品稀释后，4000rpm高速离心20min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样。

四. 仪器

高效液相色谱仪（JASCO），蒸发光散射检测器，氨基柱（4.6mm×250mm），KQ-500DB型数控超声波清洗器，纯水机。

五. 实验的技术路线

确定色谱条件→确定标准物保留时间→测定样品中各组分保留时间→计算结果

六. 操作方法

（1）色谱条件：流动相：乙腈：水=80：20；梯度方式： 1ml／min恒流；漂移管温度：75℃；待基线平衡后，再进样。

（2）保留时间法定性

a.标准物保留时间的确定

分别取葡萄糖、果糖、蔗糖等20l 注入高效液相色谱仪，分别记录各组分的保留时间。然后再将混合标准样20l 注入高效液相色谱仪，记录各组分的保留时间。

b.样品中各组分保留时间的测定

将样品溶液20l 注入高效液相色谱仪，测定各色谱峰的保留时间，与标准物保留时间对照进行初步定性。

（3）计算

外标法定量：从标准曲线中查出样品中某糖组分的含量，换算出样品实际含某组分的量

X(g/ml)=

式中：X——样品中有机酸的含量， g/ml；

A——标准曲线中查出的样品中有机酸含量， g/ml；

V——取样体积，ml；

V1——样液稀释后的体积，ml；

参考文献：

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糖品分析与检测课程总结