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发布时间：2023-11-14 15:51:48

多巴胺仿生修饰超顺磁性纳米颗粒作为基因载体的可行性研究
杨继晨;田建飞;王芹;洪清炎;付春华;董平轩
【摘要】评价氧多巴胺仿生修饰超顺磁性纳米颗粒(polymerizationdopaminemodifiedsuperparamagneticironoxidenanoparticles,PDA—SPIONs作为体外基因载体的可行性.方法:利用琼脂糖凝胶电泳对PDA—SPIONs结合DNA能力进行表征,应用绿色荧光蛋白报告基因系统,检测PDA—SPIONs将外源基因转染至HEK293T细胞系的转染可能性.结果:PDA—SPIONs对HEK293T细胞系形态产生明显影响,将外源基因转染至HEK293T细胞系的能力较弱.结论:PDA修饰的磁性纳米颗粒需进一步修饰改造才能用于体外转染的新型非病毒基因载体.【期刊名称】《德州学院学报》【年(卷,期】2018(034004【总页数】5页(P25-29
【关键词】多巴胺仿生修饰;超顺磁性纳米颗粒;基因载体【作者】杨继晨;田建飞;王芹;洪清炎;付春华;董平轩
【作者单位】德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院山东省新型药用辅料与缓控释制剂工程实验室,山东德州253023;德州学院医药与护理学院,山东德州253023;德州学院山东省新型药用辅料与缓控释制剂工程实验室,山东德州253023

【正文语种】中文【中图分类】R-391引言
基因治疗(genetherapy是近年来发展起来的一种疾病治疗新技术,该技术主要是通过对患病组织或细胞进行基因水平的操作达到治愈的目的.基因治疗中起关键治疗作用的是功能性外源基因,通过一定的工具手段将外源基因转移入靶细胞中,外源基因进行表达,达到最终治疗疾病的目的基因治疗.基因治疗的关键步骤是通过基因载体将外源基因导入细胞中发挥作用.基因载体主要可分为2大类：病毒载体和非病毒载体.其中,病毒载体效率高,是目前基因治疗的主要手段,但病毒载体存在携带基因长度有限、可能引起免疫反应与细胞毒性、具有潜在致癌性、可应用的细胞类型有限、生产和包装问题、重组复杂以及高成本等缺点[1,2].因此,非病毒载体逐渐引起研究者的兴趣.传统的非病毒载体大部分为多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物,磁性纳米颗粒具有较好的生物相容性、磁靶向性等优势,在磁共振成像(MRI、肿瘤光热治疗等领域取得广泛应用[3].多项研究发现,磁性纳米颗粒可以携带外源DNA进入细胞,可以作为一种新的转基因载体应用于外源基因的导入[4-6].聚多巴胺(poly-dopamine,PDA仿生修饰因其生物相容性好被应用于多种纳米材料的表面修饰[7].本研究在前期制备了聚多巴胺仿生修饰超顺磁性纳米颗粒(PDA-SPIONs的基础上,应用绿色荧光蛋白(GFP报告基因系统,考察了该纳米颗粒与质粒的结合及其作为转基因载体的应用情况.2试剂及仪器2.1实验试剂
质粒提取实剂盒购自天根生化科技有限公司；Lipofectamine2000(Lipo2000转
染试剂为Invitrogen产品；RPMI-1640培养基(Gibco、DMEM高糖培养基(Hyclone、胎牛血清(FBS,Excell、0.25%胰酶(索莱宝、人肺腺癌细胞株A549细胞和人源胚胎肾细胞株HEK293T细胞购自中国细胞中心协和库.含绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP基因质粒的菌株由中国科学院生态环境研究中心助理研究员任肖敏惠赠.2.2实验仪器
高速台式冷冻离心机(湖南,湘仪、微量蛋白核酸检测仪Nanodrop2000(美国,Thermo,CO2细胞培养箱(美国,Thermo、电泳仪(北京,六一、凝胶成像系统(上海,天能和DMI3000B倒置荧光显微镜(德国,徕卡.3实验方法
3.1质粒的扩增与提取
少量(10～100μL菌液无菌涂布到LB琼脂固体培养基(300μg/mL卡那霉素平板,37°C过夜培养.挑选单克隆,LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素摇培2～3h,接着按1：100扩大培养.质粒DNA提取按天根提取试剂盒操作,保存在TE缓冲液中.用超微量分光光度计NanoDrop2000进行浓度及纯度鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其高级结构.3.2凝胶阻滞电泳研究磁性纳米粒子与DNA结合能力
取4μgGFP质粒DNA,加入不同量的PDA-SPIONs,摇床孵育20min.琼脂糖(1%凝胶电泳,凝胶成像系统成像,考察PDA-SPIONs结合质粒DNA情况.为了得到磁性纳米颗粒与DNA的最佳结合量,设计不同PDA-SPIONsNP/DNA(v/w比例：0.5∶1,1∶1,1.5∶1,2∶1,2.5∶1,磁分离,上清进行琼脂糖凝胶电泳并成像.3.3细胞基因转染研究
1细胞培养.A549细胞培养基：含有10%FBS和1%双抗(100mg/mL链霉素和
100U/mL青霉素的RPMI-1640培养基,HEK293T细胞培养基：含有10%FBS和1%双抗的DMEM高糖培养基.HEK293T和A549细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的空气中培养.2体外转染.取对数期的A549和HEK293T细胞,分别以细胞密度为2×105个/mL和1.55×105个/mL接种于6孔板中,至细胞融合度80%～90%进行转染.取4μgGFP质粒至250μL无血清培养基,加入PDA-SPIONs(最佳结合比例和10μLLipo-2000(阳性对照,混匀后室温孵育10min.将转染混合物加入各孔细胞,37℃孵育5h,然后加入含10%牛血清的培养液,继续培养24h.转染结束,PBS清洗未进入细胞的纳米颗粒,再加入新鲜培养基,倒置荧光显微镜观察.4结果与分析4.1琼脂糖凝胶电泳
质粒凝胶电泳结果如图1所示,实验提取的质粒分子构型有三种,由下往上依次为超螺旋闭合环型、松弛线型和松弛开环型.所提质粒以超螺旋闭合环型为主,可用于接下来的转染实验.图1提取质粒电泳图1-4：marker和不同的质粒样品4.2微量核酸检测仪定量质粒浓度
应用NanoDrop2000对提取的GFP质粒DNA进行定量及质量检测.质粒DNAA260/A280=2.01,A260/A230=2.07,表明提取的质粒含有少量RNA,没有蛋白质、酚类污染,适合细胞转染.4.3纳米颗粒/DNA结合凝胶电泳结果
图2PDA-SPIONsNP/DNA结合电泳图a.不同比例PDA-SPIONsNP/DNA的复合物电泳图1-6:Marker,DNA,v/w1.5:1、2:1、2.5:1、PDA-SPIONsNP；b.复合物磁分离后电泳图1-6：DNA,v/w为0.5:1、1:1,Marker,v/w为2:1、2.5:1凝胶阻滞电泳实验结果见图2.图a为不同比例PDA-SPIONs/DNA混合后直接进
行凝胶阻滞电泳实验,图b为磁分离后的电泳结果.由图可知,PDA-SPIONs纳米颗粒留在胶孔处,未结合的DNA跑出电泳条带.v/w小于2时,随磁性纳米颗粒的增加,DNA跑出的条带逐渐变暗,v/w大于2时,随PDA-SPIONs磁性纳米颗粒的增加,DNA跑出的条带又逐渐变亮,表明PDA-SPIONs磁性纳米颗粒结合DNA量随着二者比例的增加先增加后减少.PDA-SPIONs磁性纳米颗粒与DNA的v/w在1.5∶1～2∶1时结合量最大.4.4磁性纳米颗粒转染结果观察
1转染预实验结果.Lipo-2000转染GFP质粒至A549和HEK293T细胞结果见图3.结果表明,Lipo-2000能够携带质粒DNA进入细胞并表达,但在两种细胞中的转染效率差别较大,HEK293T细胞转染率好于A549细胞.可能是两种细胞对纳米颗粒及DNA的摄取能力不同.图3HEK293T和A549细胞转染图a：明场;b：荧光场
2纳米颗粒转染HEK293T细胞.PDA-SPIONs与市售Lipo-2000转染试剂转基因性能的比较情况,结果见图4.图中加入PDA-SPIONs/DNA复合物的孔中未出现绿色荧光.可能是因为细胞对PDA-SPIONs/DNA复合物的内吞作用较弱,或者由于PDA-SPIONs磁性纳米颗粒与质粒DNA结合较紧,在细胞中不能有效释放,导致转染没有成功.单独加入PDA-SPIONs或PDA-SPIONs/DNA复合物的细胞生长状态良好,说明PDA-SPIONs对细胞没有毒性作用.
图4PDA-SPIONsNP/DNA转染效果图标尺：50μm.a1-f1：明场,a2-f2：荧光场；a：仅DNA;b：lipo-2000/DNA复合物;c：PDA-SPIONs;d-f：PDA-SPIONs/DNAv:w1.5∶1,2:1,2.5:15讨论
超顺磁性纳米颗粒是一种粒径小于30nm的磁性超微粒子,具有超顺磁性、表面效
应和小尺寸效应等.纳米基因载体技术是以纳米颗粒作为基因载体,小尺寸的纳米颗粒容易进入细胞并释放其携带的DNA、RNA等分子,这些分子表达或发挥作用从而实现安全有效的基因治疗[8].良好的基因载体都应具有良好的生物相容性,且在体内安全无毒,可降解,不与机体组织器官产生免疫抗原性等特点.SPIONs因其小尺寸(小于30nm,在体内可以比与病毒载体和脂质体更有效逃避巨噬细胞的吞噬,体内循环时间延长,提高基因转移效率.本实验所用PDA-SPIONs直径大小符合超顺磁性纳米颗粒[9],PDA-SPIONs/DNA转染HEK293T和A549细胞后,两种细胞形态均无明显改变.纳米基因载体制备的重点是提高装载基因量和装载稳定性.实验结果发现,当PDA-SPIONs磁性纳米颗粒与DNA的v/w在1.5∶1～2∶1时,DNA结合量最大.随PDA-SPIONsNP结合DNA量随二者比例关系呈现拱桥式变化.可能是因为DNA带负电荷,而纳米颗粒带正电荷,二者比例达到一定值时,其结合DNA量最大,低于或者高于最优比例,DNA结合量都会减少.按照最优结合比例转染结果表明,复合物中DNA的表达量很低.因此需要进一步修饰增加结合量、加入磁场增加或者改进制备条件提高转染效率.同时也可通过在PDA-SPIONs磁性纳米颗粒连接抗体和抗肿瘤药,提高其抗肿瘤疗效并减少副作用.参考文献:

【相关文献】
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[3]TranN,WebsterTJ.Magneticnanoparticles:biomedicalapplicationsandchallenges[J].JMaterChem.,2010,20:8760-8767.[4]邢珍珍,郑济林,陆宵彤,等.超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为药物载体的研究进展[J].广东医学,2015,36(22:3543-3545.[5]曹正国,孙四维,孙凯,等.超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒的制备及其作为基因载体的可行性研究[J].癌症,2004,23(10:1105-1109.[6]陈道桢,薛文群,龚健,等.PEI氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的实验观察[J].第四军医大学学报,2008,29(1:13-16.[7]LiuX,CaoJ,LiH,etal.Mussel-inspiredpolydopaine:abiocompatibleandultrastablecoatingfornanoparticlesinvivo[J].ACSNano.2013,7(10:9384-9395.[8]何雷.磁靶向基因转染复合物的构建及应用研究[D].南京:东南大学,2015.[9]SongX,GuX,SunH,etal.BiomimeticModificationandInVivoSafetyAssessmentofSuperparamagneticIronOxideNanoparticles[J].JNanosciNanotechnol,2016,16(4:4100-4107.

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