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Real-timeqPCR检测鸡胚中贝氏隐孢子虫方法研究
摘要：为检测鸡胚中贝氏隐孢子虫，本研究根据GenBank公布的贝氏隐孢子虫和原鸡18SrRNA基因序列设计针对贝氏隐孢子虫的特异性引物，并以标准基因组DNA为模板，建立贝氏隐孢子虫SYBRGreen实时荧光定量PCR（Real-timeqPCR）方法，并对含有贝氏隐孢子虫的鸡胚尿囊液样品进行检测。结果表明，建立的SYBRGreenReal-timeqPCR方法可特
异性扩增出贝氏隐孢子虫，而且建立的标准曲线线性关系良好(R2=0.998。进一步做重复性结果显示试验重现性较好。本研究建立了快速、特异的定量检测鸡胚中贝氏隐孢子虫Real-timeqPCR方法，可用于
对贝氏隐孢子虫在鸡胚中繁殖规律分析和药物筛选评估。
关键词：Real-timeqPCR；贝氏隐孢子虫；鸡胚
隐孢子虫(Cryptosporidium是寄生于人和动物胃肠道和呼吸道上皮细胞内能引起人畜共患隐孢子虫病(cryptosporidiosis的一种原虫[1]。现今，包括中国在内，在世界6大洲90个国家300多个地区已发现隐孢子虫，其能感染包括人在内的240多种动物[2]。对于免疫功能正常宿主，其主要引起自限性腹泻。对于免疫抑制患者，尤其是获得性免疫缺陷综合症（AIDS）
患者，感染后危害严重，且常常引起死亡[3]。
贝氏隐孢子虫（C.baileyi）为感染鸡的优势种，主要寄生于鸡喉头、气管、法氏囊和泄殖腔等部位，可引起雏鸡呼吸道症状，导致生产性能下降甚至死亡；当与其它免疫抑制性病原混合感染时，将造成更严重的经济损失[4]。世界上大多数国家均有鸡隐孢子虫病的报道，美国乔治亚州蛋鸡群感染率为10％~60％，肉鸡群为41％；苏格兰鸡群感染率为88％[5]。在我国，不同地域报道的鸡隐孢子虫感染率差异较大，宁夏、上海、湖南、合肥、河南等地感染率分别为27％、12.1％、36.81％、50.83％、11.40％[6]。鉴于隐孢子虫病对人类健康和畜牧业生产的巨大危害，自上世纪八十年代以来隐孢子虫病研究日益成为全球范围内人兽共患病领域内的一个研究热点。人们在隐孢子虫分类地位、种类鉴定、分子流行病学、传播机制、免疫机理、检测技术和药物防治等方面进行了大量的探索性研究，取得了丰硕的研究成
果[7]。
目前，隐孢子虫虫定量分析常用方法包括：定量PCR（real-timequantitativePCR，real-timeq-PCR、显微镜计数法（计数显微镜下每个视野中荧光标记或其它化学方法染色虫体）、酶联免疫吸附分析（ELISA）、光化学免疫分析和原位杂交比色法等[8-9]。其中Real-timeqPCR不需要对产物进行电泳和密度测定，分析快速，且灵敏度高，重现性好，为目前最常用的定量分析方法。本研究利用实验室已建立的C.baileyi鸡胚培养模型，采用Real-timeqPCR方法检测鸡胚尿囊液中C.baileyi，以期建立快速准确检测鸡胚中C.baileyi的方法，为利用C.baileyi鸡胚培养模型进行
隐孢子虫药物筛选提供定量方法。
1材料和方法1.1试验时间、地点
xxxxxx
1.2试验仪器
台式离心机（型号TDL-403）；OLYMPUS显微镜CX21；37oC恒温培养箱；分析天平；1mL注射器；鸡胚照蛋器；打孔器；血细胞计数器；
ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司。
1.3试验材料
1.3.1卵囊及试验动物：
1.3.1.1卵囊：实验室保存的已纯化的鸡源C.baileyi卵囊。1.3.1.2鸡胚：实验室孵化的购自新乡原阳某孵化厂非免疫鸡胚。1.3.2试验试剂DNA提取试剂盒：日本东洋坊公司（TOYOBO）生产的MagExtractorTM基因组提取试剂盒；SYBRGreenⅠPCR试剂盒（TaKaRa公司生产的SYBR?PrimexExTaqTMⅡ）；注射用青霉素钠，规格100万单位，批号：100904，华北制药集团；注射用硫酸链霉素，规格100万单位，批号：100302，华北制药集团；PBS原液；孔雀绿染
色液。
1.3.3试验试剂的配制
