免疫组化

实验材料：需要进行观察的脑片

存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。

所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+0.7%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8g NaCl，0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至7.2，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液

仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床

实验步骤：

1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。

2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）

3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。

4、之后，将脑片从含PBST的24孔板中取出，放入添加了二抗（1:500，一般用封闭液配）的24孔板中，放在室温摇床上孵育2h，每孔加800微升。（二抗一般根据一抗来选择，如一抗为鼠源的，二抗就选择抗鼠的；一抗为兔源的，二抗就选择抗兔的）

5、二抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于装有PBST的24孔板中洗5次，每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中，每次15分钟，放于室温摇床。

6、最后一次用PBST洗过之后，将脑片用玻璃钩取出，放于含有PBS的24孔板中洗1次，10分钟，室温摇床。

7、之后将脑片用玻璃钩取出，放在含有800微升DAPI（用PBS配制，1:10000）的24孔中进行染色，室温摇床10分钟。

8、再将脑片取出放在含有800微升PBS的24孔板中洗1次，10分钟，室温摇床。

9、展片：将载玻片和盖玻片洗净烘干，将载玻片放平于实验台上（正面朝上，反面最好垫上一个玻璃皿），在载玻片上滴加水或PBS，用玻璃钩取出脑片在滴加有水或PBS的载玻片上将脑片展开，动作要轻柔。等待晾干后，在脑片上方滴加抗荧光淬灭封片液，缓缓盖上盖玻片（注意不要留有气泡）。

10、将制备好的片子放至专门装玻片的盒子中，之后进行拍照观察（633用confocol）

注意事项：操作过程中避免强光照射，防止荧光淬灭。

免疫组化-小鼠脑切片 protocol（改正）