细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

一、准备工作：

取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。

二、细胞悬液制备：

细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三、细胞计数：

1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。

5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1：1稀释。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3。

四、细胞计数要点：

1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

五、初学者易犯的错误：

1.计数前未将待测悬液吹打均匀。

2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

六、本实验特殊试剂的配制：

4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。

使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。

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步骤：

（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(or Erythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；

细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；

细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

      存活率：225/243﹦92.6%

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 最后再随便说说 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

原理都是一样的，我大部分也是借鉴集体智慧的结晶

我个人在做的时候感觉最重要的就是悬液一定要摇均匀，否则对后续的计数影响很大

而实际上做起来也是挺简单的，多做几遍，主要的几点记住了就OK（笑）

最后，也是最重要的一点

一定要调好焦距，我们要计数的只是细胞，千万别计数其他的杂质（我最初很乌龙，汗；还好知道的人不多 = =+）

细胞计数方法