RP-HPLC法测定白花蛇舌草中熊果酸的含量

陈静;王怡甦;索连成;岳秀峰

【摘 要】目的:建立内在质量监控指标,提高药品质量标准.方法:采用反相高效液相色谱法测定该药中熊果酸的含量.结果:熊果酸在20.176～100.88μg范围内呈良好的线性关系,回归方程为Y=17237X+356217,R2=0.9999,平均回收率为99.59%,RSD为1.12%.结论:该方法重量现性好,专属性强,结果准确,可靠.

【期刊名称】《中国民族医药杂志》

【年(卷),期】2010(016)009

【总页数】2页(P68-69)

【关键词】反相高效液相色谱法;白花蛇舌草;熊果酸;含量测定

【作 者】陈静;王怡甦;索连成;岳秀峰

【作者单位】内蒙古乌海市药品检验所,内蒙古,乌海,016000;内蒙古乌海市药品检验所,内蒙古,乌海,016000;内蒙古乌海市药品检验所,内蒙古,乌海,016000;内蒙古乌海市药品检验所,内蒙古,乌海,016000

【正文语种】中 文

【中图分类】医药卫生

68 中周民族医药杂志2;010 年 9 月第 9 期RP-HPLC 法测定白花蛇舌草中熊果酸的含量陈静1王怡慰 ，索连成2岳秀峰3( l.内蒙古乌海市药品检验F 斤，内蒙古乌海 01仅剧； 2.内蒙古锡盟锡昌疗养院，北京小汤山 1但211;3.呼和浩特市环境科学研究所，内蒙古呼和浩特 010010) 摘要：目的：建立内在质量监控指标，提高药品质量标准。 方法：采用反相高效液相色谱法测定该药中熊呆酸的含量。结 果：然采酸在 20.176-100.88µg 范阂内呈良好的线性关系，回归方程为 Y = 17237X + 356217, R2= 0.现朔，平均回收率为 99.59% ,RSD 为 1.12% 。 结论：该方法重量现性好，专属性弦，结果准确，可靠。关键词：反相高效液相色谱法；白花蛇舌草 ；熊采酸；含量测定中图分类号： R291.2 文献标识码：A 文章编号：1邸－ 6810(2010)00 －伽8-02白花蛇舌尊为茜草科耳草属植物白花蛇舌草 Dul.en- 1.2.3 对照品：熊果酸为中国药品生物制品检定所提供阳ulia 榻JSa(wi - lld.) Roxb.的带根全草。性苦、甘、寒；无 （批号： 110736 - 200722）。毒。归心、肝、牌、大肠。具清热，利湿，解毒之功效。中蒙 1.2.4 色谱条件： Alltech RP - C18 色谱柱（4.6mm x 25仙run, 医在临床上广泛使用，用于治疗肺热喘咳，扁挑体炎、咽喉 5阳）， ODS 预柱：检测波长 210nm；流动相：甲醇－水（ 90: 炎、阑尾炎、摘疾、黄症、盆腔炎、附件炎、痛肿疗疮、毒蛇咬 10）；流速： l.Omhnin- 1 ；柱温： 30℃；进样量： lOµL。 伤等疾病，收载于《内蒙古中药材标准》1988 年版ω 。 由于 1.2.5 检测波长的选择：取熊果酸对照品溶液，在 200 『 “白花蛇舌革”药效较为显著，放市场上存在着多种伪品，而 300nm 波长范围内进行光谱扫描，熊果酸在 2但m 处有最 原质量标准一则不能代表中药材内在质量直公安部情况， 大吸收，考虑到末端吸收，参照中国药典 2005 年版一部“夏 二则不能够很好的进行真伪鉴别与内在质量的控制，故参 枯萃”（含量测定）项下规定的检测波长，将测定波长定为 照《中国药典》2005 年版一部（2）及相关文献（3）项下方法，对自花蛇舌革采用 HPLC 含量测定方法对其有效成分熊果酸 进行分析研究，为进一步完善与提高现行质量标准打下了 基础。线性范围考察中以峰面积积分值对进样量进行回归分 析，结果熊果酸在 20.176 ～ 100.88µg 范围内呈良好的线性 关系，回归方程为 Y =17237X + 356217, R2=0.”99。试验 结果表明：精密度良好；熊果酸在 24h 内非常稳定；加样回 收良好，回收率在 98.38% ～ 101.00% 之间 。1材料与方法 1.1 研究对象：茜草科耳革属植物臼花蛇舌草 Oul.e也n.dio.4萨JSa( wi - lld.) Roxb.的带很全萃，药用名称为白花蛇舌 草，收载于《内蒙古药材标准》1988 年版。在医药市场上购 买到山东、四川、湖北、河北 4 个产地的样品。1.2 仪器与试药 1.2.1仪器：日本岛津 2010 高效液相色谱仪；UV-2450 紫外－可见分光光度仪式Q3200DB 型数控超声波消洗糕。1.2.2试剂：甲醇为色谱纯试剂，水为重蒸馆水，其他试剂均为分析纯。作者简介：陈静，女，汉族， 1970 年出生，毕业于内蒙古医学院药 学院，2005 年普职为主管药师。联系电话： 13947到7648210nm。 1.2.6 对照品溶液的制备：精密称取在 105℃干燥至恒重的熊果酸对照品适量，加元水乙醇制成每 lmL 含 50月的溶液。 即得。 1.2.7供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约 lg,精密称定，置索氏提取器中，加乙隧适盘，浸泡过夜，加热回 流帖，回收溶剂，残渣用石油谜（ 60 - 90℃）浸泡 2 次，每次 lOmL，每次 lmin，倾去石油隧液，残渣挥干残留溶剂，用无 水乙醇溶解并转移至 lOmL 盘瓶中，加元水乙醉至刻度，摇 匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜（0.45µm）即得。 2方法学考察 2.1提取条件的确定：精密称取臼花蛇舌草药材粉末（过四号筛，产地：湖北） lg，分别考察索氏提取、加热回流提取、 超声援取等 3 种方法对含量的影响，试验结果表明采用索 氏提取制备的供试品溶液含量最高。见表 1 、2。 表1提取方法对含的影响（ n=5)索氏提取加热回流提取超声援取提取方法6h 40min 含量（n》g)1.5949 1.4028 1.3即2结果表明，采用索氏提取制备的供试品溶液测得含量明 显高于另外两种方法，故采用索氏提取法制备供试品溶液。要：目的：建立内在质量监控指标，提高药品质量标准。 方法：采用反相高效液相色谱法测定该药中熊呆酸的含量。结果：然采酸在 20.176-100.88µg 范阂内呈良好的线性关系，回归方程为 Y = 17237X + 356217, R2= 0.现朔，平均回收率为 99.59% ,RSD 为 1.12% 。 结论：该方法重量现性好，专属性弦，结果准确，可靠。毒。归心、肝、牌、大肠。具清热，利湿，解毒之功效。中蒙 1.2.4 色谱条件： Alltech RP - C18 色谱柱（4.6mm x 25仙run,医在临床上广泛使用，用于治疗肺热喘咳，扁挑体炎、咽喉 5阳）， ODS 预柱：检测波长 210nm；流动相：甲醇－水（ 90:炎、阑尾炎、摘疾、黄症、盆腔炎、附件炎、痛肿疗疮、毒蛇咬 10）；流速： l.Omhnin- 1 ；柱温： 30℃；进样量： lOµL。伤等疾病，收载于《内蒙古中药材标准》1988 年版ω 。 由于 1.2.5 检测波长的选择：取熊果酸对照品溶液，在 200 『“白花蛇舌革”药效较为显著，放市场上存在着多种伪品，而 300nm 波长范围内进行光谱扫描，熊果酸在 2但m 处有最原质量标准一则不能代表中药材内在质量直公安部情况， 大吸收，考虑到末端吸收，参照中国药典 2005 年版一部“夏二则不能够很好的进行真伪鉴别与内在质量的控制，故参 枯萃”（含量测定）项下规定的检测波长，将测定波长定为照《中国药典》2005 年版一部（2）及相关文献（3）项下方法，对自花蛇舌革采用 HPLC 含量测定方法对其有效成分熊果酸进行分析研究，为进一步完善与提高现行质量标准打下了基础。线性范围考察中以峰面积积分值对进样量进行回归分析，结果熊果酸在 20.176 ～ 100.88µg 范围内呈良好的线性关系，回归方程为 Y =17237X + 356217, R2=0.”99。试验结果表明：精密度良好；熊果酸在 24h 内非常稳定；加样回收良好，回收率在 98.38% ～ 101.00% 之间 。1 材料与方法1.1研究对象：茜草科耳革属植物臼花蛇舌草 Oul.e也n.dio.4萨JSa( wi - lld.) Roxb.的带很全萃，药用名称为白花蛇舌草，收载于《内蒙古药材标准》1988 年版。在医药市场上购买到山东、四川、湖北、河北 4 个产地的样品。1.2仪器与试药1.2.1 仪器：日本岛津 2010 高效液相色谱仪；UV-2450 紫作者简介：陈静，女，汉族， 1970 年出生，毕业于内蒙古医学院药学院，2005 年普职为主管药师。联系电话： 13947到7648210nm。1.2.6对照品溶液的制备：精密称取在 105℃干燥至恒重液。即得。1.2.7 供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约 lg,精密称定，置索氏提取器中，加乙隧适盘，浸泡过夜，加热回流帖，回收溶剂，残渣用石油谜（ 60 - 90℃）浸泡 2 次，每次lOmL，每次 lmin，倾去石油隧液，残渣挥干残留溶剂，用无水乙醇溶解并转移至 lOmL 盘瓶中，加元水乙醉至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜（0.45µm）即得。2方法学考察2.1 提取条件的确定：精密称取臼花蛇舌草药材粉末（过四号筛，产地：湖北） lg，分别考察索氏提取、加热回流提取、超声援取等 3 种方法对含量的影响，试验结果表明采用索氏提取制备的供试品溶液含量最高。见表 1 、2。表结果表明，采用索氏提取制备的供试品溶液测得含量明显高于另外两种方法，故采用索氏提取法制备供试品溶液。2010 年 9 月第 9 期中阁民族医药杂志69 表 2 索氏提取时间对含量的影响（ n=S)提取时间（h)2 4 6 含量（mg/g)1.5877 .1.63851.6364 索民提取 4h 同提取曲的结果基本一致，故确定提取时间为他。 2.2 线性范围的考察：精密称取熊果酸对照品适量，加无水乙醇制成每 lml 含 100.88闯的溶液。精密吸取 2、4、6、8、 lOmL，置 lOmL 量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别 精密吸取 10件进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分 值对迸祥盘进行回归分析。结果见表 3。表 3 标准曲线测定结果进祥盘问）20.17640.35260.52880.7041棚”峰顶积积分值 701452 10512621拍2512 1752971208θ452 2.3精密度试验：精密吸取供试品溶液（产地：湖北） 10µ1, 重复进样 6 次，测定供试品中熊果酸峰面积积分值，而D 为 0.49% 。试验结果表明，精密度良好。2.4稳定性试验：取供试晶溶液（产地：湖北），分别于 0、1、 2、4、8、12、16、24h 进样 10µ1，测得供试品中熊果酸峰面积积 分值， RSD 为 1.12% 。试验结果表明，熊果酸在 24h 内稳定 性良好。2.5重复性试验：按拟定的含量测定方法，对同一批样品 （产地：湖北）分别制备供试品溶液 5 份，测得峰面积积分 值并计算含量， RSD<2% 。结果见表 4。表 4 重复性试验结果取祥盘峰面积积含量 平均含量 RSD 序号 (g)分值(mg·g斗）(mg·g-1) (%) 1.但451248756 1.7201 1纠-080221.0911******* 1.6”4 1268776 31.08451259782 :“)42 ].“54 0.37 1261α)2 41.11621341526 1.5917 1339527 51.αm1220045 1.71(,6 1219756 2.6 回收率试验：取己知熊果酸含量的样品（产地：湖北1.而54吨• f')5 份，每份约 0.元，精密称定，分别精密加入 lmL(0.97吨·mL-1 ）熊果酸对照品溶液，按拟定的含量测定 方法制备供试品溶液，测定每份的含量。结果见表 So表 5 回收率试验结果序取样量含量对照品加测得总量回收率平均回收 RSD号 (g)（吨） 人量（吨） （吨）(%)率（%）（%） 0.5012 0.8346 0.971.8042101.002 0.5创8 0.以06 0.971.794998.683 0.51220.85300.97 1.813198.979'J.591.124 0.筑阴 0.8476.0.971.8创6 9').ITT5 0.50110.8345。.97 1.缸阴 100.55 试验结果表明，因收率在 98.38 ～ 101.00 之间， RSD 为1.12% ，加样回收良好。2.7样品含量测定：取各产地样品，按拟定的含量测定方 法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（ 50.12µg• m1-1 ）与供试品溶液各 10µ1，，注入液相色谱仪，测定并计算 含量。结果见表 6。表 6 样品中熊果E章含量测定结果产地取样量（g）峰丽积平均值含量（mg-g-1 ）平均含量（吨·g-1)山东 1.10121145207 1.58(,6 1.5854 1.0945 1139842 1.5842 湖北 1.00861220426 1.6703 1.“崩 1.0578 ******* 1.(,629 四川 1.12451345892 1.7α)4 1.6964 1.0982 1300767 1.6＇归5河北 1.0456******* 1.6372 1.6386 1.1120 1116276 1.6401 3 讨论 3.1文献记载，自花蛇舌革中所含主要有效活性成分为熊果酸与齐墩果酸，我们分别对这两个同分异构体进行了 HPLC 试验分析。试验结果表明相邻色谱峰的分离度大于 1.5 ；按熊果酸峰计算，理论塔板数（ N）为 5伽以上。由于 测得齐墩果酸含量偏低，故未收入论文正文。3.2试验中同时取空白溶剂进样，结果表明，空白溶剂在 与熊果酸色谱峰相同的保留时间处无对应峰干扰。 参考文献〔 l 〕内蒙古卫生斤．内蒙古中药材标准〔S〕．呼和浩特：内蒙古人民出版社， 1988.白．〔2〕国家药典委员会编．中华人民共和国药典〔S〕．一部．北京：化学工业出版社，2005.1叨．〔3〕吕武清．中成药中药材的薄层色谱鉴别〔M〕．北京：人民卫生出版社， 1977.192.2010 年 5 月 31 日收稿索氏提取时间对含量的影响（ n=S).1.6385 1.6364 时间为他。2.2线性范围的考察：精密称取熊果酸对照品适量，加无水乙醇制成每 lml 含 100.88闯的溶液。精密吸取 2、4、6、8、lOmL，置 lOmL 量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取 10件进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值对迸祥盘进行回归分析。结果见表 3。3标准曲线测定结果20.176 40.352 60.528 80.704 1棚”峰顶积积分值 701452 10512621拍2512 1752971208θ452 精密度试验：精密吸取供试品溶液（产地：湖北） 10µ1,重复进样 6 次，测定供试品中熊果酸峰面积积分值，而D 为0.49% 。试验结果表明，精密度良好。稳定性试验：取供试晶溶液（产地：湖北），分别于 0、1、2、4、8、12、16、24h 进样 10µ1，测得供试品中熊果酸峰面积积分值， RSD 为 1.12% 。试验结果表明，熊果酸在 24h 内稳定性良好。重复性试验：按拟定的含量测定方法，对同一批样品（产地：湖北）分别制备供试品溶液 5 份，测得峰面积积分值并计算含量， RSD<2% 。结果见表 4。4重复性试验结果平均含量RSD 序号(g) 分值1.0911 ******* 3 1.0845 1259782 1.1162 1341526 5 1.αm 1220045 而54吨• f')5 份，每份约 0.元，精密称定，分别精密加入lmL(0.97吨·mL-1 ）熊果酸对照品溶液，按拟定的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份的含量。结果见表 So5回收率试验结果号（吨）人量（吨）率（%）（%）0.5012 0.97 1.8042 101.00 0.5创80.以061.7949 98.68 0.5122 0.8530 1.8131 98.97 9'J.59 1.12 0筑阴0.8476 1.8创69').ITT 0.5011 0.8345 。.971.缸阴100.55 样品含量测定：取各产地样品，按拟定的含量测定方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（ 50.12µg•m1-1 ）与供试品溶液各 10µ1，，注入液相色谱仪，测定并计算含量。结果见表 6。6样品中熊果E章含量测定结果山东1.1012 1145207 湖北1.0086 1220426 “崩1.0578 四川1.1245 1345892 河北1.0456 ******* 讨论3.1 文献记载，自花蛇舌革中所含主要有效活性成分为熊果酸与齐墩果酸，我们分别对这两个同分异构体进行了HPLC 试验分析。试验结果表明相邻色谱峰的分离度大于1.5 ；按熊果酸峰计算，理论塔板数（ N）为 5伽以上。由于测得齐墩果酸含量偏低，故未收入论文正文。试验中同时取空白溶剂进样，结果表明，空白溶剂在与熊果酸色谱峰相同的保留时间处无对应峰干扰。参考文献〔l〕内蒙古卫生斤．内蒙古中药材标准〔S〕．呼和浩特：内蒙卫生出版社， 1977.192.2010 年 5 月 31 日收稿

RP-HPLC法测定白花蛇舌草中熊果酸的含量