SDNYGC-1-1177-2018

灵芝液体菌种制备技术规程

编 制 人：王庆武 唐丽娜 崔慧 高霞 赵淑芳 司元明 张燕 高瑞杰

所在单位：泰安市农业科学研究院 山东省农业技术推广总站

1.生产环境

（1）环境条件

远离工矿业的“三废”及微生物、烟尘和粉尘，至少300米内无禽畜场舍、屠宰场、垃圾场，无污水和其它污染源，交通便利。水质清洁能饮用，电源充足。

（2）生产车间

地面应防水、防渗漏、防滑、易清洗，排水良好；墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。车间入口设置缓冲间，门窗安装防虫纱网，通风良好。

2.仪器设备

液体菌种发酵罐、空气压缩机、配电箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、1000毫升摇瓶（或三角烧瓶）等。其中发酵罐、高压蒸汽灭菌锅应经有关部门检验合格。

3.培养基

（1）斜面培养基

马铃薯200克(去皮煮汁)、麸皮40克（煮汁）、葡萄糖20克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、琼脂20克、水1升，pH值自然。

（2）液体菌种培养基

配方1：淀粉30克，玉米粉20克，牛肉膏3克，酵母膏3克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁1克，维生素B10.5克，花生油0.5毫升，水1升L，pH值6.0～6.5。

配方2：玉米粉30克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏2克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1克，维生素B10.5克，花生油0.5毫升，水1升，pH值6.0～6.5。

4.母种活化

将保藏或引进的优质高产、抗逆性强的灵芝品种母种转接入新鲜斜面培养基上进行活化培养1次，检查有无杂菌，菌丝长满管后待用。

5.摇瓶菌种制作

（1）培养基制备

按液体培养基配方配制培养液（淀粉、玉米粉先用温水搅拌均匀），装入摇瓶中，混合均匀，装液量为摇瓶容量的60%，聚丙烯薄膜封口。高压蒸汽灭菌，121℃、0.11Mpa维持40分钟，待压力自然回零后开锅取瓶。

（2）接种培养

冷却至室温，无菌条件下，挑取5～6块1～4平方毫米母种块放入摇瓶内，避光静置24小时后置于旋转式恒温摇床上，温度25℃～28℃、转速（140～160）转/分钟培养，培养7～10天。

（3）菌种质量标准

培养液澄清透明不浑浊，无杂菌、无异味；菌丝球、菌丝片段密集，占整个培养液80%～85%，均匀悬浮于液体中不分层。

6.液体菌种制作

（1）环境灭菌

臭氧浓度0.5ppm～1.0ppm灭菌40分钟，臭氧耗尽后操作；或紫外灯灭菌30分钟后操作。

（2）装罐

按液体培养基配方配制培养液（玉米粉加水煮沸30分钟，用2层纱布过滤，取滤液，加入其它成分），装入发酵罐内，加清水定容，装液量为发酵罐容量的70%～80%。通入空气搅拌1～2分钟，混合均匀，密封盖口。

（3）灭菌

发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口20厘米，关闭进、排水阀门加热。待加热层压力达到0.05Mpa时缓慢打开排气阀降压至0Mpa，关闭排气阀，再次升压至0.11Mpa；待发酵罐培养层压力达到0.05Mpa时缓慢打开排气阀降压至0Mpa，关闭排气阀，再次升压至0.11Mpa，同时打开空气过滤器灭菌，微开排气阀，维持40～50分钟。

（4）冷却

灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至0Mpa，加热层通入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐培养层排气阀降压，待压力接近0Mpa时向培养层内通入无菌空气，调整排气阀，维持罐压0.04Mpa～0.05Mpa，培养液温度降至28℃时，关闭加热层进水阀。

（5）接种

关闭培养层进气阀和空气压缩机，调节培养层排气阀，将罐压降至0Mpa，无菌条件下（接种口用75%酒精擦拭，并用95%酒精灼烧，火焰圈套在接种口上），快速从接种口接入经确认无污染的摇瓶菌种，接种量1%～2%，关闭接种口。

（6）培养

继续通入无菌空气，调节排气阀，维持罐压0.02Mpa～0.03Mpa，培养温度25℃～28℃。培养周期7～10天。

（7）质量检测

①接种后每间隔2天，无菌条件下从出种口取样50毫升，接种于试管斜面或平板培养基上，置于30℃恒温培养1～2天，检测有无杂菌侵染。

②取样于光学显微镜下观察菌丝体形态特点，有无异常菌丝体。

③取样测定菌液酸碱度，菌液pH小于5为不正常。

④鼻嗅罐体排气阀排出的气体有无异味，有培养基料香味及灵芝特殊的味道可继续培养，有酸臭味终止培养。

⑤眼观菌液，培养前期略显浑浊，培养后期菌液越来越澄清透明，菌丝球浓度增长较快，若菌液浑浊、菌丝球数量减少、颜色深为不正常。

（8）液体菌种质量标准

培养液澄清透明不浑浊，无异味；菌丝球、菌丝片段占整个培养液80%左右，均匀悬浮于液体中不分层，直径不大于3.5毫米。

7.接种

液体菌种制备完成，将接种枪连同接种管道提前用高压蒸汽灭菌锅121℃、0.11Mpa灭菌40分钟，出种口用95%酒精灼烧，在火焰的保护下接种管道尾端接在出种口上。调整罐压至0.05Mpa～0.08Mpa，打开发酵罐出种口阀门，无菌条件下，接种枪接种。

8.清罐

接种完毕，用水清洗发酵罐、接种枪及接种管道，并对发酵罐进行空消灭菌，方法同6.（3），灭菌结束，关闭电源、水源，发酵罐压力自然降至0Mpa即可。

9.液体菌种使用期限

环境温度低于20℃，发酵罐内液体菌种持续通无菌空气，保持罐压0.02Mpa～0.04Mpa，可存放2天左右。

备注：本规程摘编于天B3709/T 133—2016《灵芝液体菌种制作技术规程》

SDNYGC-1-1177-2018灵芝液体菌种制备技术规程