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　 南京农业大学学报　 2011, 34(2:135-138　 Journal of Nanjing Agricultural University

http ://nauxb. njau. edu. cn

刘芳, 王道营, 徐为民, 等. 应用PCR⁃DGGE 指纹图谱技术分析盐水鸭贮藏过程中的细菌多样性[J ]. 南京农业大学学报, 2011, 34(2:135-138

应用PCR⁃DGGE 指纹图谱技术分析盐水鸭

贮藏过程中的细菌多样性

刘芳, 王道营, 徐为民*, 诸永志, 曹建民

(江苏省农业科学院农产品加工研究所, 江苏南京210014

摘要:利用传统平板培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE 指纹图谱相结合的方法, 对盐水鸭在4℃ 贮藏期间的细菌多样性进行了分析㊂ 传统培养方法结果显示:盐水鸭在贮藏期间细菌数量增加迅速㊂ PCR⁃DGGE 对盐水鸭及平板培养物中的细菌sp. ㊁ 中度嗜盐菌(Halomonas sp. 和盐单胞菌(Cobetia sp. 是盐水鸭的主要细菌, 而腐生葡萄球菌㊁ 溶酪大球菌和魏斯氏菌是平板培养物中的主要细菌㊂

关键词:盐水鸭; 细菌多样性; 16S rDNA ; 变性梯度凝胶电泳

中图分类号:TS251. 1　 　 　 　 文献标志码:A　 　 　 　 文章编号:1000-2030(2011 02-0135-04

组成分析结果显示:腐生葡萄球菌(Staphylococci saprophyticus ㊁ 溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus ㊁ 魏斯氏菌(Weissella

Bacterial diversity in water⁃boiled salted duck during storage

analyzed by PCR⁃DGGE

(Institute of Agricultural Products Processing , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014, China

Abstract :Traditional plate culture and polymerase chain reaction⁃denaturing gradient gel electrophoresis (PCR⁃DGGE methods were

LIU Fang , WANG Dao⁃ying , XU Wei⁃min *, ZHU Yong⁃zhi , CAO Jian⁃min

Key words :water⁃boiled salted duck ; bacterial diversity ; 16S rDNA ; denaturing gradient gel electrophoresis

water⁃boiled salted duck , while S. saprophyticus , M. caseolyticus and Weissella sp. were the main bacteria in plate culture agar.

that Staphylococci saprophyticus , Macrococcus caseolyticus , Weissella sp. , Halomonas sp. and Cobetia sp. were the main bacteria in

that bacterial communities in MRS and PCA agar plate increased quickly during storage. The analysis of PCR⁃DGGE patterns showed

used to investigate the bacterial diversity in water⁃boiled salted duck during storage at 4℃. The results of the plate culture showed

在盐水鸭传统加工过程中, 为了保持最佳品质, 熟化和杀菌工艺的温度不能超过90℃ [1]㊂ 盐水鸭不经高温高压灭菌会残留一些微生物, 以及在贮藏和流通过程中的二次污染, 使盐水鸭极易发生腐败变质[2], 这严重制约了盐水鸭的货架期与远距离的商业流通㊂ 在炎热的夏季这一问题显得尤为突出㊂ 因此, 通过科学合理的保鲜手段, 延长盐水鸭货架期, 减少腐败损失, 为消费者提供更加安全美味的肉制品, 就成为肉类食品科技工作者长期以来研究的热点问题㊂ 目前对盐水鸭的研究主要集中在加工工艺以及风味物质方面[3-5], 对其在贮藏过程中的微生物变化, 尤其是腐败菌的研究较少㊂

本研究采用传统平板培养和基于16S rDNA 为分子标记的变性梯度凝胶电泳(PCR⁃DGGE 方法对托盘包装盐水鸭在贮藏期间的微生物多样性进行研究和分析, 为低温肉制品的生产㊁ 贮藏和流通过程中的品质安全保障提供技术支持㊂

1　 材料与方法

1. 1　 样品和处理

盐水鸭样品于2009年8月中旬购自南京某盐水鸭专卖店㊂ 随机挑选8只盐水鸭, 托盘包装后置于冰盒中冷藏运输至实验室(途中运输时间不超过2h , 置于(4±1 ℃ 恒温培养箱中贮藏㊂ 贮藏1㊁ 5㊁ 8㊁ 11d 时, 每次随机抽取2只盐水鸭, 无菌条件下每只盐水鸭取5g 鸭脖和鸭翅肉, 15g 鸭胸肉, 10g 鸭腿肉及

收稿日期:2010-03-22

基金项目:江苏省自然科学基金项目(BK2010469; 江苏省农业自主创新基金项目(CX (10 440

作者简介:刘芳, 博士, 助理研究员, 研究方向为食品微生物, E⁃mail :lfklds@yahoo. com. cn ㊂ *通讯作者:徐为民, 博士, 研究员, 研究方向为肉

制品加工与质量控制, E⁃mail :weiminxu2002@yahoo. com. cn ㊂

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10g 鸭背肉, 混合捣碎, 作为试验样品进行pH 测定㊁ 微生物数量测定和总DNA 提取㊂ 1. 2　 试剂

PCA 及MRS 琼脂购于北京陆桥技术有限责任公司; 细菌基因组提取试剂盒DP302-02购于天根生化

1. 3　 pH 值测定2次[6]㊂

科技有限公司; PCR 有关分子试剂购于宝生物工程(大连 有限公司; 其余试剂为分析纯㊂

取2g 样品(2个重复, 加入18mL 去离子水(pH 7. 0, 搅匀后静置2min , 用pH 计测量, 重复

1. 4　 微生物数量测定

床振摇30min ㊂ 取1mL 上清液依次进行10倍递增稀释, 选3个合适的稀释度, 每个稀释度2个重复, 涂1. 5　 细菌总DNA 的提取

布于PCA 和MRS 平板中, 分别于37℃ 和30℃ 培养48h , 计算微生物数量㊂

无菌条件下取样品10g (2个重复, 加入50mL 灭菌生理盐水, 摇床振摇30min ㊂ 4℃ 3000g 离心

无菌条件下取25g 样品(2个重复, 加入225mL 灭菌生理盐水(含1g ㊃ L -1蛋白胨, 9g ㊃ L -1NaCl , 摇

10min , 取上清液于4℃ 下10000g 离心15min , 取沉淀置于EP 管后用无菌生理盐水溶解; 平板中的菌落1. 6　 变性梯度凝胶电泳分析

的总DNA , 所提取的DNA 溶于TE 缓冲液中, -20℃ 贮藏㊂

计数后置于无菌生理盐水中洗涤, 然后收集到无菌EP 管中[7]㊂ 利用细菌DNA 提取试剂盒提取收集细菌

1. 6. 1　 细菌16S rDNA V3可变区PCR 扩增　 参照文献[8]的方法选取PCR 引物338f (5′⁃CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG⁃3′ 和518r (5′⁃ATT ACC GCG GCT GCT GG⁃3′ , 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成㊂ 反应体系为:10×PCR

1min , 56℃ 1min , 72℃ 1min , 30个循环; 72℃ 10min ㊂ PCR 产物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测㊂

2μL , DNA 聚合酶(5U ㊃ μL -1 0. 5μL , 用ddH 2O 补足至50μL ㊂ PCR 反应条件为:95℃ 5min ; 95℃

缓冲液5μL , MgCl 2(25mmol ㊃ L -1 3μL , dNTP 4μL , 引物338f 和引物518r (50μmol ㊃ L -1 各1μL , 模板

37. 5∶1 , 变性梯度范围为35%~60%(100%变性剂含有7mol ㊃ L -1尿素和40%甲酰胺㊂ 采用美国CBS

1. 6. 2　 变性梯度凝胶电泳　 选择聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的质量比为Scientific 变性梯度凝胶电泳系统(DGGE-1001 进行电泳, DNA 扩增产物的上样量为10μL , 电泳缓冲液为1×TAE 缓冲液, 60℃ 条件下80V 电泳12h 左右㊂ 电泳结束后用EB 染色, 弃去浸泡液, 再在ddH 2O 中浸泡冲洗5min , 利用上海培清科技有限公司的JS-680B 凝胶成像分析系统照相㊂

4℃ 过夜㊂ 取2μL 为模板DNA 进行16S rDNA V3可变区域扩增㊂ PCR 产物经DGGE 后证明与所割条带BLAST 程序进行序列分析(http ://blast. ncbi. nlm. nih. gov /㊂

1. 6. 3　 DNA 的回收及测序　 在紫外灯下切下DGGE 胶上不同位置的条带, 置于20μL 无菌纯净水中

2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测, 然后委托上海生物工程技术服务有限公司测序, 将测序获得的DNA 序列采用

位于相同的迁移位置, 再割胶回收, 用不含GC 夹子的引物再次扩增16S rDNA V3可变区序列, 纯化后用

2　 结果与分析

2. 1　 贮藏期间盐水鸭的pH 及微生物数量变化

微生物数量增加迅速㊂

增加到108CFU ㊃ g -1, PCA 平板中的总菌落数从103CFU ㊃ g -1增加到109CFU ㊃ g -1, 这反映出盐水鸭贮藏期间

表1　 4℃ 贮藏盐水鸭的pH 值及微生物数量变化

Table 1　 Changes of pH value and bacterial counts of water⁃boiled salted ducks stored at 4℃

贮藏时间/d

Storage time

15118

pH

总菌数/lg (CFU ㊃ g -1 Total bacteria number

3. 45±0. 105. 40±0. 207. 02±0. 028. 94±0. 03

乳酸菌数/lg (CFU ㊃ g -1 Number of lactic acid bacteria

3. 23±0. 035. 25±0. 106. 89±0. 208. 23±0. 06

由表1可见, 在4℃ 贮藏期间样品的pH 值没有显著的变化㊂ MRS 平板中的菌落总数从103CFU ㊃ g -1

6. 33±0. 036. 30±0. 046. 37±0. 036. 40±0. 02

第2期刘芳, 等:应用PCR⁃DGGE

指纹图谱技术分析盐水鸭贮藏过程中的细菌多样性137

2. 2　 盐水鸭中细菌16S rDNA 的PCR⁃DGGE 分析

DNA 进行PCR⁃DGGE 分析, 结果如图1㊂ 2次

在贮藏期内直接提取盐水鸭中的细菌总

重复每个取样点的DGGE 图谱均无明显差异㊂ 对DGGE 图谱上分离的1~13条带进行割胶㊁ 扩增㊁ 测序, 在NCBI 网站上采用BLAST 软件进DGGE 条带测序后对应的为同一细菌, 这可能(Halomonas sp. 或盐单胞菌属(Cobetia sp. (条带1㊁ 腐生葡萄球菌(Staphylococci saprophyticus (条带5㊁ 7和11㊁ 溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus (条带6 和魏斯氏菌(Weissella sp. (条带8㊁ 9和10 的16S rDNA 条带, 说明它们是盐水鸭贮藏期间的主要腐败菌㊂ 由图1可知, 贮藏5d 后, 条带1亮度加强并且在以后的贮藏时间内一直保持很强的亮度㊂ 贮4, 但是条带2㊁ 3和4的序列通过NCBI 网站序列分析后, 与已有序列的同源性较低㊂

藏8d 后, 出现一些微弱的条带(条带2㊁ 3和

图1　 不同贮藏时间盐水鸭细菌总DNA 的PCR⁃DGGE 图谱Fig. 1　 DGGE profiles of PCR products obtained from

microbial DNA directly extracted from water⁃boiled salted ducks during different storage time

行相似性分析, 结果见表2㊂ 从表2可见, 多个

是由于16S rDNA 存在多个拷贝造成的[9]㊂ 在盐水鸭贮藏期间检测到中度嗜盐菌属

表2　 DGGE 谱图中主要条带的测序结果Table 2　 Sequencing results of DGGE bands

条带号GenBank 登录号Band No. GenBank Accession No.

1235, 14, 18

4

GU644494GU644503GU644504GU644505GU644493GU644495

亲缘关系最近的菌种(登录号

The closest relative species (Accession No.

未鉴定Unidentified 未鉴定Unidentified

腐生葡萄球菌(Staphylococci saprophyticus (EU073967 溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus (EU048336 腐生葡萄球菌(S. saprophyticus (EU073967

魏斯氏菌(Weissella sp. (FJ892731

未鉴定Unidentified

100相似度/%Identity 100

中度嗜盐菌(Halomonas sp. (DQ658939 或盐单胞菌(Cobetia sp. (EU651811

6, 15, 198, 21

7, 16, 209, 22

GU644496

10010010097

11, 17, 2412, 2513

10, 23

GU644498GU644500GU644499

GU644497

混淆魏斯氏菌(Weissella confusa (GU049413 或食窦魏斯氏菌(W. cibaria (AB510757

或绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens (EU621989 混淆魏斯氏菌(W. confusa (GU049413 或食窦魏斯氏菌(W. cibaria (AB510757

或绿色魏斯氏菌(W. viridescens (EU621989

微小杆菌(Exiguobacterium sp. (FJ013096 腐生葡萄球菌(S. saprophyticus (EU073967

食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria (EU621988

GU644501GU644502

1009999

99

2. 3　 传统平板培养物中细菌16S rDNA 的PCR⁃DGGE 分析

14㊁ 16和17 和溶酪大球菌(条带15, 并且贮藏期间一直存在; 同时还有一个微弱的代表微小杆菌(Exig⁃

从图2和表2可见, 经16S rDNA 的PCR⁃DGGE 分析, PCA 平板上的菌落主要是腐生葡萄球菌(条带

　 　 注:条带号同图1和图2㊂ The band No. is the same as in Fig. 1and Fig. 2.

uobacterium sp. 的条带(条带13, 该条带在贮藏期间一直存在, 但是亮度没有加强㊂ MRS 平板上细菌对应的DGGE 图谱中的条带相对较多, 贮藏1d 时, 检测到腐生葡萄球菌(条带18㊁ 20和24㊁ 溶酪大球菌(条带19 和魏斯氏菌属(条带22㊁ 23和25 的条带, 并且这些菌的多数条带在贮藏期间一直保持较高的

亮度; 贮藏11d 时出现了1条明显的魏斯氏菌属的条带(条带21㊂

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3　 讨论

受加工工艺限制, 盐水鸭冷藏期间的腐败问题一直困扰着江苏的肉品生产企业㊂ 本研究采用传统平板培养和PCR⁃DGGE 方法, 研究了盐水鸭贮藏期间的菌相变化㊂ 传统平板培养结果显示盐水鸭在贮藏期间微生物数量增加迅速, 这是造成盐水鸭快速腐败变质的原因㊂ 同时利用PCR⁃DGGE 方法对盐水鸭样品以及平板培养物中的细菌组成进行了分析, 发现腐生葡萄球菌㊁ 溶酪大球菌㊁ 魏斯氏菌㊁ 中度嗜盐菌和盐单胞菌是盐水鸭的主要细菌, 而腐生葡萄球菌㊁ 溶酪大球菌㊁ 魏斯氏菌是平板培养物中的主要细菌㊂ 两种研究方法的结果对比表明传统平板培养基本上能反映出盐水鸭中的实际细菌组成, 但是在盐水鸭样品的DGGE 图谱中显示中度嗜盐菌和盐单胞菌是一种优势菌, 而由于培养条件的限制在平板DGGE 方法直接对样品进行分析能够克服传统培养培养物中没有分离到该细菌㊂ 这说明利用PCR⁃

方法的不足, 能更全面地反映出盐水鸭中的细菌组成㊂ 但由于用于DGGE 分析的PCR 产物大小只有

图2　 不同贮藏时间内PCA (a 和MRS (b 平板上细菌

总DNA 的PCR⁃DGGE 图谱

Fig. 2　 DGGE profiles of PCR products obtained from

microbial DNA extracted from PCA (a and MRS (b samples during different storage time

240bp , 导致测序后不能鉴定到种, 这是该方法的一

16S rDNA V3可变区的PCR⁃DGGE 技术可以用于研究盐水鸭冷藏过程中的菌相变化, 两者结果相互验证, 在一定程度上可以发挥两种方法的各自优势㊂

参考文献:

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个局限㊂ 总体来讲, 采用传统平板培养和基于细菌

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责任编辑:沈　 波

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