microRNA实验方法

作者:

Mary Johnson

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概观miRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA分子，通过与靶RNA的3´UTR互补或部分互补结合，使其降解或介导其翻译抑制，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程.miRNAs基因通常位于基因间或编码蛋白基因的内含子中，在核内由RNA聚合酶II或III转录产生具有特征性茎环结构的pri-miRNA,然后在Drosha-DGCR8复合体的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA,它由exportin5由核内运到胞浆。在胞浆内，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟双链miRNA,其中的一条链与RISC结合而参与基因转录后水平的调控。

根据miRBase数据库，目前所发现的miRNAs已超过700个，随着高通量测序的应用，将会有更多的新的miRNAs被发现。可能近90%的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，结合基因芯片分析以及生物学实验方法来研究miRNA的功能及寻找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。

microRNA的筛选

在上千个miRNA中，哪些miRNA在特定的生物学功能起着关键的作用呢？这是研究miRNA功能所面临的首要问题。miRNA基因技术可以快速有效的提供miRNA表达图谱。通过比较正常样本与疾病样本中miRNA表达图谱的差异，寻找在生物学功能上起作用的miRNA。该技术为临床肿瘤诊断提供了新的思路，也为miRNA作为肿瘤的标志物提供了依据。然而基因芯片技术的结果是半定量的，且重复性较差,这就需要通过其它的实验方法来进一步验证。

miRNA的实验验证

为了进一步验证miRNA在组织细胞内的表达，目前常用来检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交;原位杂交; Stem-loop实时定量RT PCR.这三种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。

Northern杂交

MicroRNA是一类很小的分子，部分microRNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究有一定困难，特别是重复性较差，步骤繁琐等。目前多数研究人员采用Northern Blot，它是一种重复性好、灵敏高、直接的方法,可以用来检测microRNA的存在、表达量的变化等。而由于放射污染等原因，同位素标记的探针的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的锁核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探针，具有稳定性高、特异性好、无放射污染等优点，成为新的Northern Blot检测探针[1] [2] [3]。

图 1. Northern杂交表明从人类和小鼠来的前miR-499和成熟miR-499条带。来源于 [6]。

基本原理：将待检测的RNA分子变性后，通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,继而按其在凝胶中的位置转移到尼龙膜上，固定后再与同位素、地高辛或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的RNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

实验过程

1. 提前配制无APS和TEMED的15%的Ura-PAGE胶的混合液，即50ml of Pre-Gels：

1. Urea: 24 g

2. 40% Acrylamide: 18.75 mL

3. 5x TBE Buffer: 10 mL

4. ddH20: 0 mL

2. 器皿的清洗：器皿同Western Blotting装置。

1. 用清水冲洗干净，乙醇擦干3%；

2. H2O2 填充浸泡电泳槽、玻璃片、梳子10分钟；

3. 用0.1% DEPC处理过的水冲洗电泳槽，梳子和玻璃片。

4. 用RNAase Away 擦海绵和其他相关器材。

5. 安装配胶装置。

3. 配胶：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混匀，加入玻片中，加入10或15齿梳子。大约30-60 min 即可凝好。

4. RNA样品的准备 Small RNAs（大约107细胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加热 5min, 冰上冷却。 瞬时离心收集RNA样品。

5. 电泳：（装置同Western Blotting电泳装置），电泳液1xTBE。15% Urea-PAGE 在电泳液 1xTBE进行电泳。电压180V 直到溴芬兰到达胶的底部。根据Ambion公司的步骤，在上样之前，300V 预电泳10min（防止胶漏同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。选用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作为对照，同时将自己合成的RNA Oligo作为阳性对照（总量为1 pmol即可）。其中 溴芬兰的对应的分子量为13nt左右，二甲苯青FF对应的为40 nt左右。

6. 转膜（装置同Western Blotting转膜装置），转膜液为0.5ⅹTBE。

1. 将胶浸泡在0.5ⅹTBE大约 10min 。

2. 用EtBr （0.5ug/ml）染胶10min 后，用紫外凝胶观测RNA电泳情况(参考Ambion公司的条带分析)。用0.5ⅹTBE 洗胶 5min.

3. 用铅笔标记好转膜的面，将 Nylon membrane（GE公司）和两片厚滤纸浸泡在 0.5ⅹTBE 大约10min.

4. 制备凝胶、膜夹层。将滤纸、胶、膜、滤纸形成三明治结构，注意胶应该靠近阴极侧。注意每层间不能有气泡。

5. 装配好转膜装置，装置同Western Blotting转膜装置。

6. 于冰上300mA转膜 1 h。

7. 把膜（RNA 面朝上）放在紫外交联仪中使用4000J UV进行交联.

8. 将膜夹在厚的滤纸中间，80℃烘烤0.5-2 h，可以轻压，以防止膜发生翻卷。

9. 如果可以直接做，则放在室温即可；也可以储存在4ºC ，直到使用（可储存6个月）。

10. 亚甲蓝（methylene blue）染色 3~5min, 在可见光下 黄色滤光片对膜照相。

7. 杂交

1. 在杂交炉中37- 42℃ 在杂交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中预杂交1h , 然后将膜放入杂交袋，然后加入配好浓度的Dig-Labeled probe，在杂交炉中37- 42℃杂交过夜。Dig-Labeled probe使用浓度：将10ul的25uM的公司原液稀释十倍后分装储存，取储存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6内参）或2.7-27ul储存液/10ml杂交液（根据miRNA的量或丰度定）。

2. 37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。

3. 室温MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。

4. 室温用Blocking Solution (用MAB 10倍稀释10×Blocking Solution)封闭 1h 。

5. 室温加入anti-Dig antibody 40 min (1:10000-1:5000 in Blocking Solution)。注意：抗体用之前，应该以12000g速度离心5 min。

6. 用MABT液洗膜两次，每次15 min。

7. 膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。

8. 配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入杂交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，挤出气泡，封口，孵育5 min.

9. 挤出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。

10. 曝光2 min~1h (根据情况定)。一般内参U6在5分钟内即可显影。

实验注意事项

1. 配胶时，由于浓度较大，所以尿素比较难溶，尿素的溶解不能加热，可以采用振荡或颠倒离心管；配好的无APS和TEMED的15%的Ura-PAGE胶可以储存在室温或4℃冰箱中（可储存1个月左右）。

2. 电泳前，应该按照步骤将装置尽量进行RNAase free处理。

3. RNA上样前，300V 预电泳10min（防止胶漏，同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。此操作需要一定的训练，因为加样孔中很快会析出尿素，一旦有尿素析出对RNA电泳的形态会有一定的影响。

4. LNA探针使用前进行分装，然后冻存于-70℃冰箱中。

5. 不同miRNA杂交的温度和时间不同，需要进行条件的摸索。一般内参温度为42℃。

6. 尼龙膜紫外交联和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

原位杂交

原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。它不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平。它是分析miRNA表达组织和时序特异性的有力工具。

[放大]

图 2. miRNA原位杂交。原位杂交中阴性和阳性对照是非常重要的。来源于 [7]。

佩纳博士2009年发表的原位杂交的方法是被广泛引用的 [4]。 这方法的特点是用甲醛和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）来固定哺乳动物组织。在那篇文章中列出的补充里有实验过程的详细步骤。 miRNA是非常小的，防止miRNA在杂交过程中的损失是最关键步骤之一。EDC的固定可以不可逆地将miRNA的5'磷酸和蛋白质基质绞连。甲醛或EDC单独固定都不能防止miRNA从组织切片在原位杂交过程中损失的。此外，探头和miRNA的熔融温度由于杂交步骤中甲酰胺的干扰也会有改动。

Stem-loop实时定量RT PCR

传统实时定量RT PCR只能检测到miRNA前体，而Stem-loop实时定量RT PCR技术可以解决这一问题 [5]。Stem loop实时定量RT PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（stem loop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 二个关键步骤。该技术具有以下优点:高度特异性，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度；样品消耗少，仅需1～10 ng的总RNA；适用范围广，总RNA 、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测。

Stem-loop实时定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用茎环结构的引物，这种具有茎环结构的引物针对所需检测的目的microRNA设计，具有特异的序列，结构示意图如下所示。内参使用的是小RNA U6，U6的反转录使用的是随机引物。将反转录的产物作为real-time PCR的模板，检测目的microRNA的引物是针对目的microRNA的特异的上下游引物，检测内参使用的是针对U6的特异的上下游引物。

实验过程

1. 用 Trizol抽提total RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用异丙醇处理时需要4℃ 过夜。将抽提得到的RNA置于－80℃保存。

2. 将抽提的RNA进行反转录。反转录的体系一般使用12.5ul的体系。具体的体系如下：

1. RNase free water

2. Total RNA: 0.625ug

3. Impron buffer: 2.5ul

4. dNTPs: 2.5ul

5. RNase inhibitor: 0.625ul

6. Impron Mgcl2: 1.5ul

7. Primer: 0.5ul

8. Reverse transcriptase: 0.625ul

具体的操作是事先计算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并将剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反转录的体系做好总的MIX，再分装到每个PCR小管内。将PCR小管置于PCR仪上反转，反转的具体程序如下： 25 C 5 min ,42 C 60 min ,70 C℃15 min. 4C℃储藏

3. 反转录的cDNA作为real-time PCR检测的模板，由于real-time PCR检测灵敏性，要求每个样需要三个重复。每一个反应的用量如下：SYBR 5.0ul; Primer mix 0.2ul; cDNA 1.0ul; water 3.8ul。

4. 在八连管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。

5. 根据需要检测样本的个数，计算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具体的计算过程为：试剂单反应量X检测样本个数X3.4 ,根据计算需要的量制作MIX 。将MIX加入每个八连管的小管中。

6. 将对应的每个八连管的小管取出10ul加入96孔板，每个小管对应96孔板的3个孔，即3个重复孔。

7. 加完样品后，用专用的封膜覆盖96孔板，用专用的刮板覆盖严实。

8. 上机检测。具体PCR程序如下：

1. 50C 2 min ;

2. 95C 5 min ;

3. 95C 30 s ;

4. 60C 40 s ;

5. 72C 30 s ;

6. 95C 15 s ; 60C 30s ;95C 15 s

实验注意事项

1. 由于real-time PCR的检测十分灵敏，因此它对RNA定量的准确性要求较高，一般RNA的定量多采用3复孔定量。

2. 无论在反转录或real-time PCR加样时要求加样一定要准确。

3. 在将八连管的mix加入96孔板前一定要充分混匀，一般采取的策略是将八连管一剪为二，置于Vortex上振荡混匀，Vortex的转速不要太高，以免将管内的液体溅到盖子内。

miRNA靶基因的寻找

miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方法和生物学实验方法。将生物信息学与生物实验相结合来寻找靶基因可以很大提高准确率。

生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选。虽然预测方法各有不同, 但由于miRNA和靶基因间的作用具有一定规律性:

1. miRNA与其靶位点的互补性;

2. miRNA靶位点在不同物种之间的保守性;

3. miRNA-mRNA双链之间的热稳定性;

4. miRNA靶位点处不应有复杂二级结构;

5. miRNA 5´端与靶基因的结合能力强于3´端.

除此以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。为了得到更为可靠的靶基因预测，通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为研究重点。目前常用的预测方法主要是以下三种：

1. miRanda是最早的一个利用生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软件, 由Enright等人于2003年设计开发. 作为最早的miRNA靶基因预测软件, miRanda对3´UTR的筛选依据主要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳定性以及靶位点的保守性三个方面进行分析。基于以上三个方面，miRanda选取每条miRNA相对的3´UTR中排名前10位的基因, 作为miRNA的候选靶基因, 对于多个miRNA对应于同一靶位点的情况, miRanda则使用贪心算法选取其中得分最高且自由能最低的那一对。

2. TargetScan是Lewis等在2003年开发的一款用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件, 该软件将RNA间相互作用的热力学模型与序列比对分析相结合, 预测不同物种间保守的miRNA结合位点. 与miRanda不同,TargetScan提出了“miRNA种子区”的概念。“miRNA种子区”是指miRNA5´端第2-8位碱基与mRNA的3´UTR完全互补所在序列。此外，它也引用了信噪比来评估预测结果的准确度. 所谓信号噪声比即用已知(信号组)和随机生成的miRNA(噪声组)分别对mRNA的3´UTR进行预测, 所得靶基因数目的比值.

3. PicTarKrek等人在2005年开发的一款名叫组合靶位点的概率识别(probabilistic identification of combinations of target sites)的预测软件.它采用一种更先进的算法来预测脊椎动物、线虫和果蝇中miRNA的靶基因, 并通过实验方法进行了验证。与TargetScan一样, PicTar也强调“种子区”在靶位点识别及在转录后调控中的关键作用, 也注重miRNA和靶基因结合的自由能在靶基因翻译抑制中的关键作用。不同的是PicTar把种子序列分为“完全匹配种子序列”和“不完全匹配种子序列”,前者要求种子序列和靶基因完全互补配对; 后者在满足miRNA与靶基因结合自由能不增加的前提下允许种子序列出现错配, 但不允许G︰U 配对.同时结合以前实验数据对两类种子序列对应的 miRNA和靶基因结合自由能进行了限制, 要求“完全 匹配种子序列”的miRNA 与靶基因结合自由能小于miRNA和靶基因最优结合能的33%; 而“不完全匹配种子序列”的miRNA与靶基因的结合自由能要求小于miRNA和靶基因最优结合能的66%, 这有效地降低了假阳性率.

miRNA靶基因的鉴定

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性,利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因.目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRAN水平来寻找靶基因主要是通来在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变, 因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题. 故采用蛋白质质谱的方法可以有效弥补这个不足.同时再结合miRNA靶基因的预测方法，可以大大提高了靶基因的检出率及可靠性。

目前鉴定靶基因最直接的方法是, 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系. 这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点. 而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法. 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体, 将希望鉴定的miRNA靶基因的3´UTR构建到荧光素酶基因的3´UTR中, 然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平, 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3´UTR中是否含有miRNA的靶位点。

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microRNA前体克隆

所有人类，小鼠，大鼠microRNA前体克隆。 样例: MIR21前体克隆, MIR155前体克隆, MIR146A前体克隆, MIR34A前体克隆, MIR221前体克隆, MIR17前体克隆, MIR222前体克隆, MIR122前体克隆, MIR16-1前体克隆, MIRLET7A1前体克隆。

microRNA抑制剂克隆

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microRNA合成抑制剂

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参考文献

1. Dvinge H, Git A, Graf S, Salmon-Divon M, Curtis C, Sottoriva A, et al. The shaping and functional consequences of the microRNA landscape in breast cancer. Nature. 2013;497:378-82 PMID 23644459 CrossRef

2. Valoczi A, Hornyik C, Varga N, Burgyan J, Kauppinen S, Havelda Z. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 2004;32:e175 PMID 15598818

3. Várallyay E, Burgyan J, Havelda Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 2008;3:190-6 PMID 18274520 CrossRef

4. Kim S, Li Z, Moore P, Monaghan A, Chang Y, Nichols M, et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 2010;38:e98 PMID 20081203 CrossRef

5. Pena J, Sohn-Lee C, Rouhanifard S, Ludwig J, Hafner M, Mihailovic A, et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat Methods. 2009;6:139-41 PMID 19137005 CrossRef

6. Chen C, Ridzon D, Broomer A, Zhou Z, Lee D, Nguyen J, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005;33:e179 PMID 16314309

7. Appaiah H, Goswami C, Mina L, Badve S, Sledge G, Liu Y, et al. Persistent upregulation of U6:SNORD44 small RNA ratio in the serum of breast cancer patients. Breast Cancer Res. 2011;13:R86 PMID 21914171 CrossRef

8. Shieh J, Huang Y, Gilmore J, Srivastava D. Elevated miR-499 levels blunt the cardiac stress response. PLoS ONE. 2011;6:e19481PMID 21573063 CrossRef

9. Barrey E, Saint-Auret G, Bonnamy B, Damas D, Boyer O, Gidrol X. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS ONE. 2011;6:e20220 PMID 21637849 CrossRef

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