实验三有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶

一、实验原理

脲酶（EC3.5.6.5）广泛存在于微生物和动、植物组织中，1926年，Sumner J曾用32％的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。该酶相对分子质量为483000，由6个亚基组成，等电点4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳定，纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定1年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。

二、实验步骤

1.提取

（1）称取5g人造浮石，置小烧杯中，用2％乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。

（2）称取10g新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加50mL32％丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4min～5min,4层纱布过滤，收集滤液。

（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10mL32％丙酮，再提取一次。4层纱布过滤，滤液在4℃，3500r·min- l条件下离心8min～10niln，小心倾出上清液，计量体积。取lmL酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。

2.沉淀

脲酶在32％的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，沉淀生成更快。故：

（1）将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加2％醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生浑浊的现象，直至pH4 . 9左右。

置4℃低温下过夜，可析出沉淀。

（2）将沉淀物仔细转入预冷的离心管，3500：·而n一，离心10～。上清液回收丙酮；沉淀即为脉酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。

3.重结晶

（1）将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取0.2mL～0.4mL用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。

（2）酶溶液在冰浴中冷至2℃～4℃，搅拌下缓慢滴入等体积64％的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶，需要较长的时间，可得到较好的正方形晶体。如果将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干燥后低温保存。

三、结果计算

酶收得率（%)=（酶干重＋酶干重x测酶活留取液体体积／酶液总体积）÷样品重×100%

酶的比活力［U·mg-1，( pr.)]＝总活力／总蛋白质

报告试验结果及观察到的有关现象记载。酶制备记录表如下：

总体积

步骤

( l）提取液

( 2）粗酶

( 3）结晶酶收得率-1-1

U·ml总活力( U )mg·ml总蛋白质（mg)

U·mg-1(pr.)( % )（ml）酶活力蛋白质

比活力

四、仪器与试剂

1.家用磨粉机、冰浴设备、离心机、5mL、10mL、50mL离心管、1.5mL塑料离心管及其他常规仪器：

2.新鲜大豆或大豆粉；

3.人造移石（专用于吸附氨Permutin颗粒状人造浮石）;

4.2％醋酸：冰醋酸2mL用蒸馏水稀释至l00mL ;

5.64％和32％丙酮：丙酮原液按体积百分比用蒸馏水配制。

有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶