植物组培技术常见问题及其预防措施
发布时间：2023-04-15 20:50:20
植物组培技术常见问题及其预防措施摘要主要对植物组培技术中常见问题如污染、材料褐变和玻璃化现象等方面进行阐述，并在此基础上提出相应对策。关键词植物组织培养技术；常见问题；预防措施中图分类号：S722文献标志码：B文章编号：1673-890X（2015）36-0-02植物组织培养技术作为当代生物科学中最有生命力的一门学科，应用广泛，在农业、林业、工业和医药业等行业均有涉及，且产生了巨大的经济和社会效益，但由于组培育苗操作程序复杂，各种技术难题仍受到广大科研工作者的困扰，如污染、材料褐变、瓶苗玻璃化等常见问题屡见不鲜，试验组培成功的植物多样，但利用组培规模化生产的植物并不多见，下面对该技术中常见的三大问题（污染、材料褐变和玻璃化现象）及预防措施进行阐述[1-4]。1污染问题1.1污染原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。在实验室及规模化生产中，组织培养中污染时有发生，造成污染的原因主要有以下几点：培养基以及在培养过程中的各种器具灭菌不彻底；培养时外植体消毒不彻底；接种和培养环境不清洁；接种人员无菌操作不严格；培养容器原因，包括盖子和封口膜等。此外，材料灭菌不彻底同样也会造成成批接种材料被细菌污染，而且
培养过程不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染[5-9]。1.2污染的预防措施1.2.1灭菌彻底严格各个环节的操作流程，特别是培养基及操作过程中的各种器具必须要严格灭菌。培养基灭菌有以下要求：耐高温培养基在121～123℃条件下灭菌20～30min。其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。最后，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗[10-14]。1.2.2选择适当的外植体要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。一般来说，培养时，田间生长的材料带菌会比在温室生长材料多；从带菌数量多少来看：多年生木本材料多于一二年生的草本材料；老的材料多于幼嫩的材料。茎尖外植体培养时注意的是：预培养，在室内或无菌条件下进行；冲洗，用水冲洗后插入无糖的营养液；发枝，以新抽的嫩枝作为外植体；暗培养后取材，要求在无菌条件下暗培养，从抽出的徒长黄化枝条上取材。以上措施均可明显减少污染。1.2.3外植体消毒外植体上可能附着外生菌和内生菌。外生菌可以通过表面消毒方法杀灭；而内生菌生
长的植物材料内部，表面消毒难以杀灭，培养一段时间后，病原菌自伤口处滋生。防治内生菌首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或消毒剂。1.2.4环境消毒环境消毒在降低培养污染率中尤为重要，且在高温高湿的条件下污染率会显著增高，需要注意到的是，必须定期进行熏蒸或喷雾消毒。各类消毒方法因人因环境而异：高锰酸钾和甲醛熏蒸对人体有一定伤害，但是其消毒效果明显，一般每年熏蒸2～3次。日常推荐使用的紫外线照射消毒以及臭氧消毒机消毒同样可以有效降低污染率，而且对人体的伤害也不大。1.2.5严格无菌操作在接种时，要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身带菌，要定期对过滤器进行清洗和更换。2材料褐变在植物组织培养中，由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，从而出现了褐变这种现象。它严重地影响外植体的脱分化、再分化和生长，对培养过程的损失显而易见[15-17]。2.1产生机理
产生的机理分为2种：非酶促褐变和酶促褐变。在植物组织培养中，由酶促褐变引起的褐变被认为是主要根源，其中引起褐变的酶有很多种，主要是由多酚氧化酶PPO、过氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等组成。在初次培养和继代培养过程中，经过测定试管苗的褐变程度和PPO的活性，有研究表明PPO活性与褐变程度的高低具有显著的相关性。2.2抑制措施在抑制褐变的方法上，目前已经有了诸多有效的处理措施，主要从以下方面来展开：去氧化；抑制特异性酶；通过有效手段控制或减少中间产物的产生。具体措施如下。2.2.1预处理措施外植体材料的预处理：冲洗外植体，在2～5℃的低温下处理12～24h，升汞或酒精消毒，取外植体浸泡10min后培养（浸泡时采用0.1%漂白粉溶液）。2.2.2取材措施在外植体的取材过程中需要注意以下几点：褐变程度较小的品种和部位更适宜；幼苗褐变程度低；夏季材料褐变趋向性更明显；早春和秋季的材料更合适取材。2.2.3培养基的质量控制培养基的状态和类型与褐变程度具有明显的相关性，因此，更要注意对培养基的成分的质量控制，严格把关，减少污染率。2.2.4抑制剂和吸附剂的选择
在长期的组织培养过程中，目前已经广泛的使用了褐变抑制剂及部分吸附剂，目的是最大程度的降低褐变程度，以降低不必要的经济损失。由此，可以在培养基中加入PPO抑制剂以及部分抗氧化剂，如偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸等。常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。2.2.5细胞筛选措施为剔除易褐变的细胞，经常性进行细胞筛选在组织培养过程中是很有必要的一项措施，在外植体接种环节里，在接种后的1～2d立即转移，使其再次转移到其他新鲜培养基中继续培养，降低培养物的毒害作用，经过连续转移（一般5～6次），褐变程度显著下降[18]
