简述二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法

自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。在化学中，这种现象称为“氧化”。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。

一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。

特别是二氧化氮自由基，随着吸烟者人数的增加、空气环境的污染程度的加重，都直接或间接的导致了人体内二氧化氮自由基数量的增加。N02主要来源于煤炭燃烧和汽车尾气排放,室内N02主要来源于燃煤灶、燃气灶的使用和抽烟等。近年来,关于N02诱导各类疾病病死率上升的流行病学数据大量涌现,特别是有学者指出,N02会影响心脑血管系统和神经功能,并提示肺和支气管不是N02毒性作用的唯一靶器官。因此在第一部分实验中,我们首先对正常大鼠进行了不同浓度(0、5、10和20 mg/m3) N02的吸入染毒处理,进而从氧化应激、炎性反应和细胞凋亡等多个角度考察了 N02对心脑组织的毒性作用。

所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。下面我们就来了解一下二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法。

1、二氧化氮自由基的来源

人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基以及少量活性氮自由基。

香烟烟雾中有许多活性自由基， 一氧化氮是一种主要成分，它可生成二氧化氮自由基（·），引起不饱和脂肪酸自氧化和对低密度脂蛋白（ ）的氧化，引发癌变与心脏疾病，导致与吸烟有关的口腔癌与肺癌发生发展主要通过呼吸进入人体,因此呼吸系统是它的主要毒性作用紀器官。空气中的自由基主要来源于，

N02具有疏水性,吸入后直达肺部深处,对上呼吸道的刺激作用较小,而主要作用于深部呼吸道、细支气管及肺泡。N02吸入轻则可引起呼吸道阻力增加和纤毛运动减弱、上呼吸道黏膜与支气管慢性炎症、肺泡吞嘴细胞吞唾能力下降及对感染的敏感性增加等,重则导致呼吸困难、肺炎、肺水肿、紫甜、昏迷,甚至死亡等。

2、二氧化氮自由基的检测。

在长期进化过程中，生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基。实验证明，体内具备一套完整的防止活性氧自由基损伤的机制，即抗氧化剂和抗氧化酶，它们统称自由基清除剂。人在正常情况下，它们可以维持体内自由基代谢的平衡，使人体处于健康状态。如一旦出现自由基代谢的不平衡，或叫“氧化应激”，有可能导致疾病发生。

近年来，在心血管疾病的发病机制中活性氮及其产生的硝化应激已逐渐成为国内外学者的研究热点。所谓硝化应激(nitrative stress)，是由过量 NO 或由NO 衍生的活性氮族（reactive nitrogen species, RNS）与活性氧族共同联合发生的生物化学反应，其特征是细胞内蛋白质中的酪氨酸硝化成 3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，NT)，从而引起蛋白质结构和功能改变，进一步对细胞产生多种毒性作用，导致细胞损伤或凋亡的病理状态。硝化应激的标志物主要为活性氮，活性氮指的是 NO（nitric oxide）与由 NO 与 ROS 衍生的自由基或非自由基活性产物，如 NO2、HNO2、ONOO-、NO2C1 等。在心血管方面，活性氮介导的硝化应激参与了多种疾病的病理生理过程。如心肌缺血-再灌注损伤、内毒素血症心功能异常、动脉粥样硬化、高血压等。那么怎样才能消除多余的自由基呢？

（1）人体内自生的自由基清除剂

　　我们人体本身存在有两大抗氧化系统，一为酵素型（酶），例如：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase简称SOD)，它是消除超氧阴离子自由基的酶；谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase)；过氧化氢酶(CAT)，它是消除过氧化氢和羟自由基的酶等，人体本身可由体内自行合成。;但因环境、年龄等因素的影响，导致生理机能不顺畅，而造成合成的能力渐渐减少，越来越难满足我们身体每日的需要；虽然我们食入的动植物食品含有这些酶，但在消化过程中都将首先被分解为氨基酸，然后根据需要再在体内合成，但是如果饮食中缺乏合成它们的原料，就可能造成这些酶的缺乏和活性降低，比如，在制造谷光甘肽过氧化物酶时，必须有矿物质硒的参与。为了补充这种酶，应摄取含硒的食物。如动物的肾脏、牡蛎、鳕鱼、比目鱼等。另一种非酵素型，例如：维生素E（VitE）和维生素C（VitC）、β-胡萝卜素（β-carotene）等则需由饮食补充；许多天然植物中含有抗氧化物质，如五谷类食物、十字花科蔬菜、蕃茄、黄豆、绿茶、有机酸等抗氧化物质。

（2）常见的外源型自由基清除剂

　　正常人体有一套清除自由基的系统，但是即便如此，这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，随着时间的推移，自由基还是会在细胞内不断地积累。细胞会在不断的氧化过程中失去它们的机能最后死亡。致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。为了防御自由基的损害，可以向生命机体额外添加些自由基清除剂，从而达到抵抗疾病延缓衰老的目的。　茶 茶中的有效成分茶多酚是一种抗氧化剂物质，凡经常饮茶的地区，其居民患癌症的比率较少。由此可见茶多酚能消除自由基防止癌症的发生。我国很多中草药中的有效成分都是抗氧化剂物质，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等。

3、二氧化氮自由基的检测方法

简便、快速、准确的自由基检测技术和方法是研究自由基生物学作用机制的关键。自1900年,M.Gomberg首次证实三苯甲基自由基以来,自由基参与生命过程中许多重要的生化反应逐步为人们所认识,特别是随着现代检测分析技术的日新月异,自由基在生物和医学领

域的作用研究迅速发展。航空航天环境条件下,自由基广泛参与了低压、缺氧、超重、失重及太空辐射所诱导的生物体损伤效应,而寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测方法成为研究自由基生物学作用的关键。检测自由基传统的方法和技术主要有分光光度法、化学发光法、色谱技术、电子自旋共振技术等。二十世纪九十年代以来,借助现代化的检测、分析手段,一些新方法及传统方法的改进应用到生物自由基研究领域。另外,电子自旋共振技术

是检测自由基的最有效手段之一,在此基础上,电子自旋共振三维成像技术的发展,为自由基的检测开辟了新天地。

一氧化氮(nitric oxide,NO) NO是一种自由基性质的小分子气体,参与了神经系统、免疫系统和心血管系统的调节作用。直接检测活体组织内的NO比较困难。Kojima[15]等设计合成了一种标记NO的新型荧光探针:二胺荧光素(DAFs)。DAFs与NO反应后荧光强度增加100倍,DAFs的乙酸盐可透过细胞膜,利用激光共聚焦扫描显微镜可实时检测细胞内NO。本室利用ESR技术比较了NO 3种自旋探针:咪唑类氮氧自由基、血红蛋白和N-甲基-D-葡萄糖胺二硫代甲酸铁[(MGD)2Fe2+]捕捉生物体内的NO,结果证明以[(MGD)2Fe2+]为捕捉剂适合检测生物组织内的NO[16],灵敏度可达到nmolPmg(蛋白)水平。Artz[17]等将微小氧电极(Clark电极)用一层NO选择性透过膜密封,改造成NO工作电极,该电极可直接插入脑组织,可以直接检测到脑组织内皮层释放的NO,灵敏度可达nmolPL。NO2-PNO3-是NO稳定的最终代谢物,通过测定NO2-PNO3-的含量,可以推算出NO的释放量。NO2-与对氨基苯磺酸乙二胺反应,其产物在548 nm处有吸收峰,用分光光度计测定其吸光度,该方法称为Griess法。用甲醇或二乙醚对待测体液样品去蛋白处理,并用NADPH还原酶将样品中硝酸盐还原成亚硝酸盐,可有效地提高Griess法的灵敏度[18]。Everett[19]等采用HLPC技术分离测定了NO2-、NO3-含量,灵敏度可达0.1 mmolPL。

自由基化学简述二氧化氮自由基的来源、清除和检测方法