1.血浆凝固酶试验：

原理:金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝集颗粒；游离型的血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。

大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。因此，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合凝固酶（用玻片法测试），另一种是游离凝固酶（用试管法检测）。

方法：（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。

（如出现颗粒状凝集现象即为阳性。如不立即发生凝集，可稍待一，二分钟，并轻轻摇动玻片，加速反应，若无凝集时则为阴性。） 

（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。），混匀后置37℃水浴中，每30min观察1次结果。若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。

（观察结果，将试管微微倾斜，血浆成冻胶样凝块者为阳性，血浆仍为液状者为阴性。 ）

【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。

【注意事项】（1）最好使用EDTA抗凝的兔血浆，因为如果使用枸缘酸盐抗凝血浆会产生假阳性结果（2）玻片法：10秒内观察结果，如超过10 秒可出现假阳性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

2. 耐热核酸酶试验

原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色

玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上6-8个孔径为2-5mm的小孔，各孔分别加一滴经沸水浴3分钟处理过的待检葡萄球菌和阳性阴性对照葡萄球菌培养物，35℃大气环境孵育3小时，观察有无粉红色圈及其大小。

划线刺种法：将葡萄球菌24小时肉汤培养物沸水浴处理15分钟，用接种环划线刺种于甲苯胺蓝DNA琼脂平板上，36℃±1℃培养24小时，观察刺线周围有无淡粉红色出现。

结果：玻片法孔外出现粉红色圈的为阳性；划线刺种法在刺种线周围出现淡粉红色为阳性。金黄色葡萄球菌耐热核酸酶阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌耐热核酸酶阴性。

3. 葡萄球菌肠毒素的测定方法

（一）反向间接血凝法（RPHA）的原理

先将各型肠毒素抗血清通过化学试剂吸附或偶联于绵羊、鸡和人“O”红血球表面，然后再加入被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试验简便、快速，检出灵敏度高，可达1ng/ml，1h-3h小时即可判定结果。

（三）检验程序

固体检样100g，加入0.85%NACL100ml，4°C浸泡18-24h，用纱布过滤；液体检样直接吸取100ml，高速均质3min，4500r/min离心30min。吸取上清液装入透析袋，包埋与PEG中4°浓缩过夜。用3ml生理盐水分数次将透析袋内容物洗出将样液移入5ml离心管中，7000-8000r/min离心20min。

取上清液，加入1mol/l氢氧化钠或盐酸，调节PH为7.0。确定在同一块板上的致敏血球的型别种类，每一种类型须各有一个阳性和阴性对照，并做好标记。

每孔加25μl样液，同时在对照孔中各加25μl阳性对照物和阴性对照物，并排除气泡在每孔中迅速加入25μl1%的致敏血球把血凝反应板放在微量混合器上充分混匀。取下血凝反应板，用玻璃板盖住表面置37°C。

报告。

（四）结果判定

（1）++++：血球呈均匀凝集，布满整个孔

（2）+++:血球大部分凝集，较（1）稍小

（3）++：血球50%凝集，边缘较松散，孔底有少量颗粒积沉

（4）+：血球在孔底沉淀面积较大，周围有散在的少量集。

（5）+/-：血球下沉至孔底，周围有较少凝集。

（6）-：血球下沉至孔底呈点状，边缘控齐。

一般“++”以上作为阳性结果。

(1) ELISA法

测定原理：利用双抗体夹心ELISA法，测定金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。

方法：将金黄色葡萄球菌肠毒素抗体用0.1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释成5ug/ml，取200ul加入聚苯乙烯酶标板每孔中，36℃孵育30分钟后用0.02mol/L pH7.2吐温-20缓冲液洗涤五次。再加入待测标本200ul，36℃孵育60分钟后，同上洗涤。每孔加入酶标抗体200ul,36℃孵育30分钟后，同上洗涤。加入酶反应底物，36℃孵育30分钟后，加入2mol/L硫酸50ul。至酶标仪上读取OD值。

结果：测定空余阴性对照孔的OD比值>=2为阳性，<2为阴性。

(2) 动物试验

原理：金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是一种耐热性蛋白质，通常在100℃30分钟不被破坏，注入动物后可产生食物中毒的症状。

方法：将金黄色葡萄球菌48小时肉汤培养物煮沸30分钟（杀死金黄色葡萄球菌而不破坏肠毒素），并经3000r/min离心1小时后，取上清液2ml注入幼猫静脉或腹腔，15分钟-2小时内观察幼猫的情况。

结果：幼猫发生呕吐，腹泻，体温升高，畏寒体颤等症状，表明动物肠毒素试验阳性，无变化则为阴性。这是检测金黄色葡萄球菌是否产生肠毒素的体内试验，可用于诊断金黄色葡萄球菌引起的人类食物中毒。

4. 甘露醇发酵实验

原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变成黄色。（原培养基中的酚红褪去，培养基显示原本的颜色）

鉴定：将待检验菌落接种于甘露醇发酵管，35℃大气环境孵育18-24小时后观察结果。

结果判读：培养基浑浊，由紫色变为黄色为甘露醇发酵试验阳性，仍为紫色者为阴性。

5.触酶试验

原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。

操作步骤:

取3％过氧化氢溶液0.5ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1~3 ml滴加入盐水菌悬液中。

结果判断:

培养物出现气泡者为阳性。

注意事项

1.细菌要求新鲜。

2.不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。

3.需用已知阳性菌和阴性菌作对照。

临床意义:

在革兰阳性球菌中，肠球菌属和链球菌属触酶试验阴性，葡萄球菌属和微球菌属阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。

金黄色葡萄球菌