申请代码 : C160102

受理部门:

收件日期:

受理编号:

国家自然科学基金

国家自然科学基金

申 请 书

(2008版

资助类别:面上项目

亚类说明:

附注说明:

项目名称:检测 NPM 基因突变并探讨 NPM 对白血病细胞生物学特性的影响 申 请 者 :张伶 电话: 023-********

依托单位:重庆医科大学

通讯地址:重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室

邮政编码:400016 单位电话:023-********

电子邮件:cqumszhl@sina.com

申报日期: 2008年3月12日

国家自然科学基金委员会

国家自然科学基金申请书 2008版

第 2 页 版本 1.003.844

基本信息

姓 名 张伶

性别 女

出生

年月

1970年 1月

民 族 汉族

学 位 博士 职称 副教授

主要研究领域 临床血液学与检验 电 话 023-******** 电子邮件

cqumszhl@sina.com

传 真

个 人 网 页

工 作 单 位 重庆医科大学 /医学检验系 申申申申 请请请请 者者者者 信信信信 息息息息 在研项目批准号 名

称 重庆医科大学

代 码

63004601

联 系 人 袁军 电子邮件 yj6848@yahoo.com.cn 依 托 单 位 信 息 电

话 023-********

网站地址

www.cqums.edu.cn

单 位 名 称

代 码 University of Oxford

00000000 合 作 单 位 信 息

项目名称 检测 NPM 基因突变并探讨 NPM 对白血病细胞生物学特性的影响

资助类别 面上项目

亚 类 说 明

附注说明

申请代码 C160102:检验医学 C140402:血液与淋巴系统疾病

基地类别

2005-56:临床检验诊断学教育部重点实验室\部门开放

预计研究年限 2009年 1月 — 2011年 12月 研究属性

应用基础研究

项项项项 目目目目 基基基基 本本本本 信信信信 息息息息 申请经费

32.5000万元 摘摘摘摘 要要要要

(限 400字 :最近国内外文献报道近三分之一的急性髓系白血病患者可发生核仁磷酸蛋白 (NPM基因突变及 NPM 蛋白胞浆移位,提出一种新的白血病亚群(NPMc+ AML 。它的出现 有助于完善白血病的 WHO 分型、预后判断和微量残留病监测,因此迫切需要建立适合临床 的 NPM 突变检测方法,并进一步阐明 NPM 突变在白血病发病中的作用机制。本项目首先采 用 PCR 技术在分子水平上检测 NPM 基因突变,同时利用荧光标记自制的突变型 NPM 蛋白单 抗在细胞水平上检测胞浆蛋白;然后通过转染将携 NPM 突变基因或者 NPM 基因 RNA 干扰片 段的病毒重组体导入白血病细胞系中, 采用软琼脂克隆形成实验、 FCM、 RT-PCR 和滤膜小室 法等方法检测靶细胞增殖潜能、周期分布、凋亡特性和趋化性的改变,观察 NPM 突变对白 血病细胞生物学特性的影响。本研究将推动 NPM 突变这项新指标在临床血液学检验的广泛 应用,同时也有助于了解 NPM 基因突变在白血病发病中的分子机制。

关 键 词 (用分号分开,最多 5个 核仁磷酸蛋白,基因突变,白血病,检测,分子机制

国家自然科学基金申请书 2008版

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项目组主要 项目组主要成员 成员 (注: 项目组主要成员不包括项目申请者,国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。

编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称

电话 电子邮件

项目分工 每年工 作时间 (月 1 王利 1973-3-24 女 主治医师 博士 University of Oxford 44-1865-

220344 liwangls@yahoo.com 课题指导和 6 2 陈辉 1970-3-5 男 副教授 博士 重庆医科大学 023-********

chenhuichh@163.net 检测方法学 评价

5 3 骆展鹏 1978-1-14 男 硕士生 其他 重庆医科大学 023

-68485223 lwzdpm@163.com 检测 NPM 突 基因表达 10 4 何鹏 1978-4-27 男 硕士生 其他 重庆医科大学 023-********

hepeng000@sina.com 病毒载体构 建及转染 10 5 钟晓明 1975-6-16 男 硕士生 学士 重庆医科大学 023

-68485223

zxm93477@163.com 单抗制备及 10 6 杨松 1978-9-5 男 硕士生 学士 重庆医科大学 023

-68485223 yangsong_alex@sina.com

FCM 检测和 趋化实验 10 7 王箭 1969-11-23 男 实验师 其他 重庆医科大学 023-********

wxy890729@yahoo.com.cn

实验技术指 导

8 8 高玉洁 1985-2-14 女 硕士生 学士 重庆医科大学 023

-68485223 413yujie@163.com 细胞生物学 特性检测 10 9

总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9 2

2

5

说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报(含申请者 ,总人数自动生成。

第 4 页 版本 1.003.844

经费申请表 (金额单位:万元

科目

申请经费

备注(计算依据与说明

一 . 研究经费 研究经费 26.8750 占申请经费的 83%,符合基金委≥65%的规定。 1.科研业务费

4.2000

(1测试/计算/分析费 2.0000 FCM 检测细胞周期、 转染目的基因的表达以及凋亡。 (2能源/动力费 0.8000 细胞培养用 CO2气体等。 (3会议费/差旅费

0.7000 参加国内学术交流。 (4出版物/文献/信息传播费 0.7000 文献查新和上网费等。 (5其它 0.0000

2.实验材料费

21.4750 购买实验相关试剂和耗材。 (1原材料/试剂/药品购置费 20.5000

购买病毒载体、 多种抗体、 购买两种白血病细胞系,

体外实验相关试剂等。

(2其它 0.9750 实验耗材等。 3.仪器设备费 0.0000 (1购置 (2试制 4.实验室改装费 5.协作费

1.2000 科研协作。

二 . 国际合作 国际合作与交流费 与交流费 与交流费 1.5000 参加国际学术会议,符合基金委≤15%的规定。 1.项目组成员出国合作交流 1.5000 2.境外专家来华合作交流 三 . 劳务费 劳务费 2.5000

用于支付研究生和临时佣工的劳务费(共 3年 , 在基金委规定的 15%范围内。

四 . 管理费 管理费

1.6250 占申请经费的 5%,符合基金委≤5%的规定。 合 计 计

32.5000

国家其他计划资助经费

其他经费资助(含部门匹配

10.0000 与本项目相关的 其他经费来源

其他经费来源合计 其他经费来源合计

10.0000

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报告正文

(一 立项依据与研究内容 1. 1. 项目的立项依据 项目的立项依据

1. 临床上白血病分型和微量残留病监测面临的困境

白血病是血液系统的恶性克隆性疾病, 正确的诊断及分型对指导治疗和判断预后至 关重要。传统的FAB分型主要是以形态学为基础,但由于白血病细胞的高度异质性和多 态性,容易受主观因素的影响。 1999年世界卫生组织 (WHO提出了急性髓系白血病 (acute myeloblastic leukemia,AML的分型新标准,要求运用形态学、免疫学、细胞 遗传学、分子生物学等资料对白血病进行诊断分型,相对于主要依赖形态学进行诊断的 FAB 标准而言是一个重大的进步。WHO分型强调细胞遗传学和基因异常对于分型及判断 预后的重要作用,临床上接近一半的AML患者可以通过WHO分型结果指导治疗和判断预 后。 然而, 还有一半的患者被笼统定义为“ “ 无明 无明显特征的 显特征的 显特征的AML AML AML” ” , 其中包括染色体核型正 常的患者,这类患者在分子学水平上其实是具有异质性的,目前尚没有一个特异的指标 目前尚没有一个特异的指标 来明确限定此群体 [1]。因此,寻找这类AML在分子遗传学上的共同改变,进一步完善WHO 分型标准是白血病诊断研究的重点。微量残留病(minimal residual disease,MRD被认 为是白血病复发的主要根源,动态监测MRD协助治疗是白血病检验的重要内容。目前MRD 监测指标大多是各型AML对应的不同融合基因,缺乏通用的白血病MRD监测指标,且大部 分核型正常的AML更无可供选择的基因改变。 最近研究发现近三分之一的成人 成人 成人AML AML AML患者出 患者出 现特异性的核仁磷酸 现特异性的核仁磷酸蛋白 蛋白 蛋白((nucleophosmin, NPM 突变 突变, 这一发现立即引起了国内外检 验工作者和白血病研究者的极大兴趣。

2. AML 患者发生 NPM 基因突变的临床意义

NPM 基因位于染色体 5q35, 编码含有 12个外显子的核仁磷酸蛋白。 正常情况下 NPM 蛋白主要定位于核仁颗粒区,可穿梭于核仁、核质和胞质之间,参与核糖体合成和中心 体复制, 调控细胞周期进程以及细胞凋亡。 NPM 蛋白在调控血细胞发育过程中起重要作 用, 能够保护造血干细胞免受低氧刺激和 DNA 损伤诱导的凋亡, 是应激状态下造血干细 胞生长存活所必需的分子 [2]。 2005年 Falini B [3]等首先在 等首先在《 《 新英格兰医学杂志 新英格兰医学杂志》 》 上撰文提 出 成人 AML 患者可存在 NPM 基因突变 基因突变。 。 我们及时跟踪到这项重大发现,并在国内首发 了第一篇相关综述 {核仁磷酸蛋白突变与血液肿瘤.中国实验血液学杂志, 2007; 15(3 :662-666},建立了 NPM 基因突变检测方法{临床检验杂志,2008;26(1:20-23}

。

目前认为 NPM 是 AML 发生突变频率最高的基因,可出现在 50%~60%染色体核型 正常的 AML 患者和三分之一的成人 AML 患者,并分布在除 M3、 M4eo 、 M7以外的 AML 各 FAB 亚型中。自 2005年以来陆续发现有四十余种 NPM 基因突变的变异体,大多是在外 显子 12的不同位置插入不同的核苷酸导致的,主要以六种变异体(mutation A-F为主, 其中最常见的是 mutation A(约占 70% , 是在野生型 NPM 核苷酸序列上第 956-959位上插 入一个 TCTG 四核苷酸而形成串联重复序列,导致 NPM 蛋白 C 端的色氨酸发生突变,形 成一个核输出信号序列,最终使 NPM 移位形成胞质 NPM 蛋白 [4]。在伴有 NPM 突变 AML 患者的白血病细胞胞浆中能检测到大量突变型的 NPM 蛋白,因此被命名为胞浆型 NPM 蛋白阳性 (cytoplasmic NMP, NPMc + 的 AML 。 NPMc + AML 患者往往染色体核型正常, 不伴有 AML 的重现性基因异常, 具有独特的临床特征和基因表达谱, 这些生物学特性使 NPMc + AML 成为独立的白血病亚群 成为独立的白血病亚群,因此Falini B等 [5]在2006年建议把 建议把 建议把NPM NPM NPM突变这一新 突变这一新

指标纳入 指标纳入WHO WHO WHO分型标准 分型标准

分型标准,以弥补当前WHO分型标准中不能细分核型正常AML群体的不足。 NPM突变除了有助于白血病诊断分型外,还用于监测MRD。研究发现NPM基因突变仅 发生在白血病细胞,并不累及正常血细胞,提示NPM基因可作为白血病区别于正常骨髓 的标志。2006年Gorello P等 [6]首次利用定量PCR检测NPM突变基因,发现白血病患者稳定 表达 NPM 突变基因,并贯穿于整个病程, NPM 突变基因cDNA拷贝数的变化与临床进程有 显著相关性,提出 提出 提出将 将 NPM 基因突变作为监测 基因突变作为监测MRD MRD MRD的新指标 的新指标 的新指标。 。 此外,临床发现AML患者检测 NPM基因突变可以帮助预测骨髓移植的效果。对 NPMc + AML 患者施行骨髓移植并不能改 善病情;而未见NPM突变的患者接受骨髓移植后则得到明显的血液学缓解,病情得到控 制 [7]。 因此, NPM突变的检测不但有助于对AML患者进行准确的诊断分型和MRD监测, 而且 能够辅助临床医生对患者能否做骨髓移植做出正确的决策 能够辅助临床医生对患者能否做骨髓移植做出正确的决策。 。

3. NPM 基因突变在 AML 发病机制中的研究现状

发生 NPM 突变的 AML 患者,除了有 NPM 基因突变导致 NPMc +现象外,往往并 不同时伴发其它已知 AML 致病基因的改变 [8]。 NPM 基因突变到底在白血病的发病机制 中扮演怎样的角色呢?研究发现,在粒系、单核系、红系和巨核系等多谱系白血病细胞 可发生 NPM 基因突变,而 NPMc +主要累及 CD34-、CD133-、FLT-3+ 等少数白血病造血干 /祖细胞亚群 [[9]。利用基因芯片对比分析 NPM 野生型和突变型白血病细胞基因表达谱, 发现 NPMc +细胞特异性表达白血病干细胞发育必需的相关基因,这可能赋予 NPMc +细 胞具有白血病干细胞样恶性表型 [10],提示 NPM 突变可能在早期造血细胞阶段参与调控

白血病克隆的恶性增殖 白血病克隆的恶性增殖。 。

目前认为 NPM 基因突变参与 AML 发病主要是通过 NPM 蛋白胞浆移位来调控细胞 凋亡和增殖特性。 NPM 突变蛋白在移位过程中可将位于核仁内的抑癌蛋白 ARF 一同带 入胞浆,使 ARF 失活或水平降低,通过人双微体蛋白(HDM2影响 p53转录活性,导致 导致 p53失活 失活, , 细胞抵 细胞抵抗凋亡 抗凋亡 抗凋亡, 同时 ARF 自身的失活也将刺激核糖体合成促进细胞周期进程, 导致细胞过度增殖 [11]。然而, NPM 是一个多功能基因,它的突变失活在白血病细胞恶性 转化的作用机制尚未完全阐明。

4. 白血病 NPM 基因突变研究中有待解决的问题

目前 NPM 突变体的检测方法分为 2大类:一类是在分子水平上检测 NPM 基因突变水 平,另一类是在细胞水平检测胞浆移位的 NPM 蛋白。目前检测 NPM 突变基因首先是采用 PCR 扩增 NPM 基因,然后对扩增产物测序以确定突变有无,或者通过毛细管电泳和变性 高效液相色谱鉴别出突变型 NPM 基因 [12]。 这些方法操作 这些方法操作繁琐且需要特殊仪器 繁琐且需要特殊仪器 繁琐且需要特殊仪器, , 不利于在 临床检验中的推广应用

临床检验中的推广应用,急需建立直接检测临床最常见 NPM A 型突变 cDNA 的 PCR 方法, 并进一步完善定量检测 NPM 突变基因拷贝数的方法以用于监测 MRD。 NPMc +是 NPM 突变 AML 患者最重要的细胞学改变,目前无论通过免疫细胞化学还是免疫荧光染色技术来检测, 都是借用抗野生型 NPM 蛋白的单抗 [13]。由于 NPM 突变蛋白主要改变 C-端部分氨基酸, 对 N-端正常的氨基酸组成没有影响,因此靶向 靶向 N -端氨基酸的市售 NPM 单抗虽可用来 单抗虽可用来检 检 测 NPM 蛋白 蛋白, , 但难以区分胞浆阳性是移位的突变型 NPM 蛋白还是过量 蛋白还是过量表达的野生型 表达的野生型 NPM 蛋白 蛋白。 。 目前制备突变型 NPM 蛋白抗体的文献未见报道,国内外也无成品出售,采用经典 的单克隆抗体技术制备突变型 NPM 蛋白特异性的单抗,建立灵敏的免疫荧光技术是将 NPM 突变新指标推向临床检验的重要环节。

在 NPM 基因突变与 AML 发生的机理研究中,NPM 突变引起 p53失活是白血病抗凋 亡的主要分子机理。已知 p53活性是维持基因组稳定性的重要因素,若 p53失活将导致

细胞基因组的不稳和核型异常, 而多数 NPMc +AML 患者往往染色体核型正常,

因此 p53在 NPM 介导的抗凋亡途径中的作用还有待进一步研究 介导的抗凋亡途径中的作用还有待进一步研究。 。 最近 Kerr LE [14]发现 NPM 蛋白 是促凋亡蛋白 Bax 新的分子伴侣, 在 NPM 蛋白胞浆移位过程中可驱动蛋白的位移, NPM 突变是否直接作用于 p53下游转录靶 Bax 而调控细胞凋亡值得深入探讨 而调控细胞凋亡值得深入探讨。 。

最近 Zhang W等 [15]在人胚胎肾细胞 293中发现 NPM 蛋白能够与趋化因子受体 CXCR4胞浆结构域结 合,胞浆过度表达 NPM 蛋白可抑制 CXCR4介导的的趋化性。 NPM 蛋白胞浆移位是否

同样影响白血病细胞的趋化性呢 同样影响白血病细胞的趋化性呢? ? 白血病细胞中过量表达的胞浆 NPM 蛋白可能发挥更 多不同的功效, 新近研究发现 NPM 基因突变在白血病发生过程中的确扮演不同角色 [16]。

根据以上研究背景,我们的研究思路为:首先建立临床适用的 NPM 突变基因和 蛋白的检测方法,然后通过转染病毒重组体使白血病细胞 NPM 突变基因表达或沉默, 通过一系列体外实验观察靶细胞生物学特性的改变, 以确定 NPM 基因突变在 AML 发病 中的作用。

其意义在于 其意义在于::

① 由于缺乏简捷快速的 NPM 基因突变检测方法和 NPM 突变蛋白特异性抗体 突变蛋白特异性抗体, , 因此本课题建立 NPM 突变检测方法 突变检测方法, , 将推动 NPM 突变这项新指标在白血病的诊断分 型 、 治疗方案选择以及 MRD 监测上的临床应用 监测上的临床应用。 。

② NPM 突变与 AML 的发生发展密切相关 的发生发展密切相关, , 因此本研究探讨该基因突变对白血 病细胞生物学特性的影响 病细胞生物学特性的影响, , 为进一步深入理解白血病的致病机理提供新的依据 为进一步深入理解白血病的致病机理提供新的依据。 。

主要参考文献

1. VardimanJ W, Harris NL,. Brunning RD,et al.. The World Health Organization (WHO classification of the myeloid neoplasms. Blood, 2002, 100(7: 2292-2302

2. Li J, Sejas DP, Rani R, et al. Nucleophosmin regulates cell cycle progression and stress response in hematopoietic stem/progenitor cells. J Biol Chem, 2006,281(24:16536-16545.

3. Falini B, Mecucci C, Tiacci E, et al. Cytoplasmic Nucleophosmin in Acute Myelogenous Leukemia with a Normal Karyotype. N Engl J Med, 2005;352(3:254-266.

4. Falini B, Bolli N, Shan J, et al. Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryptophan(s are crucial for aberrant nuclear export of nucleophosmin leukemic mutants in NPMc_AML. Blood, 2006;107(11: 4514-4523.

5. Pasqualucci L, Liso A, Martelli MP, et al. Mutated nucleophosmin detects clonal

multilineage involvement in acute myeloid leukemia: Impact on WHO classification.. Blood, 2006;108(13:4146-4155.

6. Gorello P, Cazzaniga G, Alberti F, et al. Quantitative assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia carrying nucleophosmin (NPM1 gene mutations. Leukemia , 2006; 20(6:1103–1108.

7. Bardet V, Costa LD, Elie C, et al. Nucleophosmin status may influence the therapeutic decision in de novo acute myeloid leukemia with normal karyotype. Leukemia.

2006;20(9:1644-1646.

8. Falini B, Mecucci C, Saglio G, et al.NPM1 mutations and cytoplasmic nucleophosmin are mutually exclusive of recurrent genetic abnormalities: a comparative analysis of 2562 patients with acute myeloid leukemia.Haematologica. 2008,93(3:439-442.

9. Falini B,Nicoletti I, Martelli MF, et al. Acute myeloid leukemia carrying

cytoplasmic/mutated nucleophosmin (NPMc+ AML: biological and clinical features. Blood, 2007;109(3:874-885.

10. Alcalay M, Tiacci E, Bergomas R, et al. Acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic nucleophosmin (NPMc_AML shows a distinct gene expression profile characterized by up-regulation of genes involved in stem-cell maintenance. Blood, 2005;106:899-902.

11. Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, et al. Delocalization and Destabilization of the Arf Tumor Suppressor by the Leukemia-Associated NPM Mutant. Cancer Res,

2006;66(6:3044-3050.

12. Roti G, Rosati R, Bonasso R, et al. Denaturing high-performance liquid chromatography: a valid approach for identifying NPM1 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn, 2006,8:254-259.

13. Falini B, Martelli MP, Bolli N, et al. Immunohistochemistry predicts nucleophosmin (NPM mutations in acute myeloid leukemia. Blood, 2006,108(6:1999-2005.

14. Kerr LE, Birse-Archbold JL, Short DM,, et al. Nucleophosmin is a novel Bax chaperone that regulates apoptotic cell death. Oncogene. 2007;26(18:2554-2562.

15. Zhang W, Navenot JM, Frilot NM, et al. Association of nucleophosmin negatively regulates CXCR4-mediated G protein activation and chemotaxis. Mol Pharmacol.

2007,72(5:1310-1321.

16. Cheng K, Grisendi S, Clohessy JG, et al. The leukemia-associated cytoplasmic

nucleophosmin mutant is an oncogene with paradoxical functions: Arf inactivation and induction of cellular senescence. Oncogene. 2007,26(53:7391-7400.

2、项目的研究内容 项目的研究内容 项目的研究内容、 、 研究目标 研究目标, , 以及拟解决的关键问题

2.1. 研究目标 研究目标

(1 建立在基因和蛋白水平检测 NPM 突变的实验方法。

(2 观察表达或者沉默 NPM 突变基因对白血病细胞系生物学特性的影响。

(3 探讨 NPM 基因突变参与白血病发病的分子机制。

2.2 研究内容和

研究内容和拟解决的关键问题

拟解决的关键问题

(1 建立定性和定量检测 NPM 突变基因水平的实验方法

建立直接检测临床最常见突变类型(NPM mA的 RT-PCR 方法。定量 PCR 检测 NPM 突变基因拷贝数,并进行方法学评价。制备 NPM 突变蛋白单克隆单抗。

(2 针对 NPM 突变所在的 C-端氨基酸,利用单克隆技术制备特异性的 NPM mA单 抗,建立灵敏的免疫荧光法检测 NPM 突变蛋白的胞浆移位。

(3 导入/沉默 NPM mA基因对白血病细胞体外生物学特性的影响

构建携 NPM mA基因重组体和靶向 NPM mA的 shRNA 表达载体, 分别感染 NPM mA阴性的急性单核细胞系 THP-1和 NPM mA阳性的急性髓性白血病细胞系 OCI/AML3。利 用细胞和分子生物学实验技术,从细胞增殖、凋亡以及趋化性等多个角度观察感染前后 靶细胞周期、增殖、凋亡和趋化性等生物学特性的改变。 3、拟采取的研究方案及 拟采取的研究方案及 可行性分析

3.1 研究方案

第一部分

第一部分 建 立 PCR 技术检测 NPM 突变基因水平的方法

突变基因水平的方法

实验分组:阳性细胞对照组:OCI/AML3细胞系;

阴性细胞对照组:NIH3T3细胞系

正常细胞对照组:正常人外周血或骨髓细胞

(1RT-PCR 检测 NPM 基因 A 型突变及测序鉴定

根 据 下 列 引 物 :Forward 5'GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC3' , Reverse 5'CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA3',检测样本中 A 型突变的 NPM 基因(480bp 。为验 证 PCR 检测结果,以 5’-GGCATTTTGGACAACACA-3’为测序引物对 NPM 基因扩增产物进 行序列分析,Chromas 软件分析测序结果。

(2RQ-PCR 检测 NPM 突变基因拷贝数及其方法学评价

构建 A 型突变 NPM 质粒载体(pEGFP-C1-NPM mA,以 5个不同浓度质粒 DNA 作 为模板进行 RQ-PCR,制备标准曲线。扩增不同 NPM 突变类型应用相同的 Forward 引物 (cNPM-F和探针(c.Probe ,分别靶向 Exon11和 Exon11/12交界处,而不同 NPM 突 变类型的 Reverse 引物(NPM mA-R或者 NPM mB-R序列则靶向 Exon12 cDNA的不同位

置,如下图。

表1 RQ-PCR引物和探针序列 cNPM-F

5’-GAAGAATTGCTTCCGGATGAC-3’ c.Probe

5’-FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3’ NPM mA-R

5’-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3’ NPM mB-R 5’-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3’

以 ABL 为内参照基因相对定量 NPM 基因表达水平,按照常规 RQ-PCR 操作。

建立线性检测范围进行灵敏度检测,通过重复性实验计算批内、批间变异系数。同 时检测野生型和突变型 NPM 基因对建立的 RQ-PCR 法进行特异性分析。

第二部分 第二部分 建立免疫荧光技术检测 NPM 突变蛋白胞浆移位的方法

突变蛋白胞浆移位的方法 (1单克隆抗体技术制备 NPM 突变蛋白抗体

1.PCR技术扩增NPM A型突变体(NPM mA的cDNA:通过设计引物从pEGFP-C1-NPM mA质 粒中扩增长度938bp片断,其中包括两个限制酶位点和Factor Xa识别序列。PCR产物和 原核表达载体pET-32a均用 Bam H I和 Hind Ⅲ双酶切后回收,T4连接酶后转化克隆菌DH5α,提取重组质粒双酶切鉴定并测序。重组质粒再转化表达菌BL21(DE3 ,IPTG诱导表 达。 分离并溶解含目的蛋白的包涵体, 过Ni-NTA柱纯化Trx—His-NPM mA蛋白, 用Factor Xa切割形成具有天然蛋白构型的NPM mA蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定,胶回收得到蛋白质纯 品。

II.NPM mA 蛋白免疫小鼠:提取的蛋白质免疫 6~8周龄雌性 BALB/C小鼠,历经基础免 疫、加强免疫和冲击免疫后,取小鼠脾细胞与 SP2/0细胞融合,HAT 筛选融合细胞,用 NPM mA蛋白分别做为抗原包被 96孔板,用间接 ELISA 筛选阳性克隆。采用美国冷泉港 实验室推荐方法鉴定抗体并测定效价。

III.大规模用 BALB/C小鼠腹腔接种单克隆抗体细胞株,收集腹水,纯化抗体。

(2建立免疫荧光染色检测胞浆 NPM 突变蛋白

利用 FITC 标记抗 NPM mA单克隆抗体,按常规免疫荧光染色的操作步骤对样本进

行荧光染色,并在荧光显微镜下观察胞浆内的阳性染色结果。

备选方法 备选方法::如果获取的 NPM

mA 抗体量偏少,可用选择灵敏的 FCM 来检测 NPM 突变 蛋白, 而市售通用型 NPM 单克隆抗体不能鉴别出野生型和突变型蛋白, 因此这也是 NPM mA 抗体的独特优势。

第三部分 第三部分 构建携 NPM mA基因重组体和靶向 NPM mA的 shRNA 表达载体

(1重组体的构建

I.构建携 NPM mA

基因的逆转录病毒重组体:

同法构建含野生型 NPM 基因的 pMSCV-EGFP-NPM wt 对照载体、含 GFP 报告基因的

pMSCV-EGFP 空白对照载体。

II. 构建靶向 NPM mA的 shRNA 表达载体:

同法构建靶向随机序列的阴性 shRNA 载体。

(2转染细胞和测定转染效率

加入含病毒颗粒的新鲜上清液感染细胞,NPM mA病毒液感染 NPM mA阴性的 THP-1细胞,NPM mA-shRNA病毒液感染 NPM mA阳性 OCI/AML3细胞,同时检测其转染效率。

(3靶细胞内目的基因 mRNA 和蛋白表达鉴定

I. 检测 NPM mA基因 mRNA 表达:RT-PCR 定性分析靶细胞目的基因 mRNA 表达,实时 荧光定量 RT-PCR 检测靶细胞目的基因拷贝数的变化。

II.检测 NPM mA 蛋白表达:荧光显微镜观察、流式细胞术(FCM 检测转染后靶细胞胞 浆内目的蛋白的表达; Western blot检测靶细胞靶蛋白表达量。

备选方法 备选方法:由于临床上 NPM 突变易发生在 AML 中的急性单核细胞白血病

(M5 亚型, 且观察单核细胞趋化性在操作上具有可行性,因此选择 M5型的 THP-1细胞作为研究对 象。如果实验中 THP-1细胞的转染效率不高,可考虑同样来源的 U937细胞进行实验。

第四部分 第四部分 导入 导入//沉 默 NPM mA基因对白血病细胞生物学特性的影响

基因对白血病细胞生物学特性的影响 实验分组:目的基因导入组:MSCV-GFP-NPM mA转染 THP-1细胞,对照组包括:NPM wt转染组、空载体转染组和未转染组。

目的基因沉默组:NPM mA-shRNA转染 OCI/AML3细胞,对照组包括:阴性

shRNA 转染组、空载体转染组和未转染组。

(1检测细胞周期和增殖潜能:

I. 检测细胞周期以及调控因子:FCM 检测 G0/G1期、 S 期和 G2/M期细胞的分布。 II.软琼脂克隆形成实验和 MTT 法检测细胞增殖能力。

(2检测细胞凋亡和相关信号分子:

I. 应用 Annexin V/PI 双染色通过 FCM 检测细胞凋亡水平。

II.RT-PCR 和 Western blot分析 p53及其下游靶分子 Bax 基因和蛋白的表达。

III. FCM 分析凋亡效应因子 Caspase-3的活化。

(3检测靶细胞的趋化性:

I.RT-PCR 和免疫印迹方法检测趋化因子受体 CXCR4基因和蛋白水平。

II.用改良的 Boyden 小室微孔滤膜法观察 THP-1细胞的体外侵袭能力。

备选方法 备选方法::如果免疫印迹方法检测 CXCR4蛋白失败,可改用 FCM 来代替。

3.2 可行性分析

(1 NPM 是调控细胞增殖和凋亡的重要基因, 最近发现 AML 细胞常常发生 NPM 突

变,主要累及早期造血细胞,并表达白血病干细胞样基因表达谱。临床资料证实与白血 病的发生发展密切相关, NPM 突变可能在 AML 发病中起重要作用。 因此建立检测 NPM 突变的方法,进一步阐明 NPM 突变在白血病发生中的分子机制,在立论上 在立论上 在立论上依据充分 依据充分 依据充分。

(2 在技术路线上,设计靶向突变基因的 PCR 引物和单克隆抗体技术制备 NPM 突 变蛋白抗体是关键,建立的 RT-PCR 检测方法能够扩增 NPM 突变基因,正常细胞内野 生型 NPM 则不能扩增出目的条带,该方法的特异性已在骨髓标本和白血病细胞系中得 到验证;抗体制备过程中每一步骤通过严密的实验设计,选择便于重组和易于转染的 NPM mA基因序列构建重组体,靶向突变蛋白的 C -端氨基酸序列保证抗体的特异性。 酶 切 和 测 序 共 同 鉴 定 确 保 重 组 体 准 确 无 误 。 本 实 验 室 保 存 逆 转 录 病 毒 质 粒 pSuppressorRetro, 并具有 RNA 干扰相关的技术平台。 体外建株的 AML 细胞系群体中 包括 NPM 突变阳性或者阴性的细胞系作为研究对象, 较 AML 原代骨髓细胞在实验操作 上更具可行性。前期工作取得了较为满意的实验结果 前期工作取得了较为满意的实验结果

前期工作取得了较为满意的实验结果,为该课题的深入研究打下了坚实 的基础, 同时关键环节上有备选方案支撑 关键环节上有备选方案支撑 关键环节上有备选方案支撑。 因此,

在技术路线上实验设计合理方法成熟。 (3 项目组成员学历、年龄结构合理,研究生精力充沛,思维活跃,具备较扎实的 理论知识和熟练的操作技能。项目组海外成员王利博士多次在英国进修深造,目前在英 国牛津大学分子血液学实验室进行血液肿瘤发病分子机制研究。

(4 项目负责人所在的重庆医科大学临床检验诊断学为国家重点学科 国家重点学科

国家重点学科(中华人民共 和国教育部教研函 [2002]2号, 学科代码 100208 , 学术氛围浓厚, 具有稳定的科研队伍。 其临床检验诊断学实验室为省部共建教育部重点实验室(教育部教技函 [2005]73号 , 具有良好的技术平台和先进的工作条件。硬件设施齐备,可提供本项目所需的全部仪器 设备。本课题所需试剂、细胞系以及动物等实验材料可自备或有商品化供应。

因此,本课题可行性强,能够实现研究目标,可按期保质完成。

4、 本项目的特色与创新之处

(1 建立直接检测 NPM mA基因的 PCR 方法,并首创单克隆技术制备靶向 C-端氨 基酸的 NPM mA 单抗,建立检测 NPM 突变蛋白的特异性方法,为 NPM 突变用于临床 WHO 分型和微量残留病监测奠定实验基础。

(2 通过基因重组导入 NPM mA和 RNA 干扰沉默 NPM mA基因这两种分子生物学 手段, 体外观察 NPM 基因突变对白血病细胞生物学特性的影响, 探讨 NPM 基因突变在 白血病发病中的重要作用。

(3 结合现代生物学技术,从细胞周期、增殖潜能、凋亡特性以及趋化性等多个角 度,力图阐明 NPM 突变影响白血病细胞生长的分子机制。

5、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划及预期研究结果

5.1 年度研究计划

2009.01-2009.06 完成实验材料和试剂的准备,查阅资料,检索查新。

2009.07-2009.12 建立 NPM 突变基因检测方法并进行方法学评价。

2010. 01-2010.06 制备单抗并建立 NPM 突变蛋白的实验方法。

2010.07-2010.12 携目的基因病毒液感染对靶细胞体外生物学特性的影响。

2011.01-2011.06 NPM突变影响白血病细胞生物学行为的分子机制研究。

2011.07-2011.12 课题总结、鉴定并申报成果。

5.2 预期研究结果

(1 建立定性定量检测 NPM 突变基因表达的 PCR 方法。

(2 获得特异性的 NPM 突变蛋白单抗,并建立免疫学检测方法。

(3 成功构建携带 NPM mA基因的逆转录病毒和靶向 NPM mA基因的 RNA 干扰表达

载体,并能够影响靶细胞的生物学特性。

(4 寻找 NPM 突变调控白血病细胞体外生长的可能分子机制。

(5 拟在国外相关专业杂志发表学术论文 3~4篇,国内 CSCD 类专业杂志发表文章

5~6篇。及时进行成果鉴定,并申报科技进步奖。

(6 培养研究生 3~4名。

(二 研究基础与工作条件

研究基础与工作条件 1、 工作基础与 工作基础与已取得的前期研究 已取得的前期研究 已取得的前期研究成绩 成绩

(1 工作基础

临床血液学检验是我室教学和科研工作的主要内容, 其中寻求白血病新的检验方法 和探讨发病机制是我们多年来一直坚持的研究方向。申请人曾经对脐血造血活性、白血 病来源的树突状细胞以及 AML 细胞系的生物学特性等课题进行了一系列深入研究。 2005年检索到第一篇有关白血病 NPM 基因突变的文章就激发了本课题组成员们浓厚的兴趣, 并与 NPM 基因突变研究处于领先地位的意大利学者 Falini B一直保持良好的学术交流, 课题组在开展前期工作时得到他热情的技术支持,目前论著正在陆续投稿。因此,本课

题组为完成申请项目打下了坚实的工作基础。

同时申请人有主持多项市级课题的经历, 项目组成员先后参加过市级课题研究的培 训,所有成员皆经过系统的实验技术培训,并熟练掌握了本课题研究所需的 PCR 、 FCM 检测、 逆转录病毒载体构建及转染、 RNA 干扰技术、 Boyden 小室微孔滤膜法等核心实验 技术,为完成本项目打下了良好的实验基础。

(2 已取得的前期研究 已取得的前期研究成绩 成绩

1 NPM 突变基因检测方法的 突变基因检测方法的前期 前期 前期实验结果 实验结果

建立 RT-PCR 检测 NPM 突变基因 mRNA 的方法, 可从靶细胞中扩增出大小为 480 bp 的 NPM mA目的条带 (图 1 。

图1.白血病细胞中 NPM mA mRNA的表达

2 NPM 突变蛋白检测方法的 突变蛋白检测方法的前期 前期 前期实验结果 实验结果

① PCR 扩 增 包 含 NPM mA 蛋 白 C -端 氨 基 酸 的 目 的 片 段 :利 用 引 物 (CGGGATCC ATCGAAGGTCGT GAAGATTCGATGGACAT,红色为限制酶位点,兰色为 Factor Xa识别序列, CGCGCGACCGAGCGG AAGCTT CTATTTTCTTAAAGAGAC , 扩增 938bp 的目的片段, 图 2。

1-4:NPMmA(935bp;M:DL2000 Marker

图 2.NPM mA基因片段 PCR 产物电泳图

②构建目的基因原核表达载体:连接 PCR 产物和原核表达载体 pET-32a,转化克隆菌后 获得 pET32a-NPMmA 重组质粒,进行酶切和测序鉴定,见图 3,图 4。下一步重组质粒 再转化表达菌 BL21,进行后续实验。

1,2:重组质粒;3,4:Marker;5,6:重组质粒双酶切

图 3.pET32a-NPM mA

重组质粒酶切鉴定

图 4.pET32a-NPM mA重组质粒部分测序结果

③建立了免疫细胞化学染色检测 NPM 蛋白:购买市售 NPM 抗体,建立 APAAP 法检测白 血病细胞胞浆 NPM 蛋白,结果见图 5,为后续用制备 NPM

突变蛋白抗体奠定实验基础。

图 5 THP-1细胞中 NPM 蛋白的表达(APAAP×400

3 NPM 突变影响白血病细胞生物学特性的 突变影响白血病细胞生物学特性的前期 前期 前期实验结果 实验结果

①pMSCV-GFP-NPM mA 病毒载体构建的前期工作:已构建携带目的基因的 pEGFP-C1-NPM mA 质粒,证实 NPM mA 基因序列的正确插入,质粒鉴定结果见图 6。在此基础上进一步构建 pMSCV-GFP-NPM mA病毒载体。

M:标记物;1:NPM mA cDNA PCR扩增产物 上图框内为

NPM mA基因序列中插入的 TCTG

2:pEGFP-C1;3:BspE1/EcoR1双酶切质粒 下图箭头指向突变对应于 NPM 野生型中的插入位点

图 6.pEGFP-C1-NPM mA质粒酶切和测序鉴定结果

②RNA干扰技术沉默 NPM 突变基因的前期工作:按照 Bam H Ⅰ 终 止 信 号 . . . . + Ⅰ + Ⅲ 设 计 NPM 基 因 shRNA 互 补 双 链 以 构 建 干 扰 质 粒 pGenesil-1/NPM。 结果发现干扰质粒可稳定转染 THP-1细胞, 具有较高的荧光强度 (图7 , 能够有效抑制靶细胞 NPM mRNA的表达,实验组产物条带亮度明显减弱(图 8。 RNA 干扰技术能够白血病细胞 NPM 突变基因, 后续实验可参考 NPM 干扰靶位点构建病毒载体。

A: pGenesil-1/NPM转染组 ; B: pGenesil-1/neg转染组(荧光显微镜×100 图7.pMSCV-GFP病毒载体转染THP-1细胞后GFP的表达

M: DL2000; 1: 未转染细胞 ; 2: pGenesil-1转染细胞 ; 3: pGenesil-1/neg转染细胞 ;

4: pGenesil-1/NPM转染细 ; 5: blank

图8.转染前后THP-1细胞NPM1 mRNA的表达

③掌握THP-1和OCI/AML3两种AML细胞系的体外培养方法, 建立软琼脂克隆形成实验观察 白血病细胞的增殖潜能,图9。

倒置显微镜(10×40

图9.THP-1白血病细胞克隆

上述部分实验结果以“核磷蛋白 A 型突变体对髓性白血病细胞系增殖的影响”一文 发表在临床检验杂志,2008;26(1:20-23。其它资料已整理成文,审稿处理中。因此, 前期大量的研究结果为本项目完成奠定了坚实基础, 课题组有信心和能力继续本项目研 究,可望取得预期研究结果。

2、 工作条件

工作条件

申请者所在的重庆医科大学临床检验诊断学为国家重点学科 (中华人民共和国教育 部教研函 [2002]2号, 学科代码 100208 , 其分子诊断生物学实验室为重庆市重点实验室 (批号:2000-2 ,临床检验诊断学实验室为省部共建教育部重点实验室(教育部教技函 [2005]73号 ,具有良好的技术平台和先进的工作条件。曾分别得到世界银行贷款、香 港华厦基金会资助及 2001年日元贷款等资金共累计 1000万元。 2001年列为 “ 国家重点 学科 ” 后, 2002-2003年获得国家重点学科建设资金及地方政府配套资金近 1000万元, 并且今后每年将继续获得国家和地方政府支助。另外投资 8000万元兴建的科技大楼已 投入使用。

目前已有的主要设备和仪器是:低温超速离心机 60 000×g,低温高速离心机 20 000×g,低温高速离心机 10 000×g,普通核酸电泳仪, DNA 测序仪,实时荧光定量 PCR 仪,凝胶数字成像分析仪,流式细胞仪, PCR 扩增仪,全自动台式灭菌仪, -85℃超低 温冰柜,倒置荧光显微镜及数字图像分析系统, CO 2培养箱,自动酶标仪,紫外 /可见分 光光度计 (UV-265荧光分光光度计 (RF-540,纯水器, 10m 2的冷房,无菌室和超净工作 台,紫外灯箱及照相系统及分子生物学实验室的常规仪器及设备。所以我们已具备实施 本项目的实验条件。

3、 申请人简历

3.1 申请人简历

张伶

张伶:女, 38岁,博士,副教授,硕士研究生导师。 学历 学历::1993年 7月,在重庆医科大学医学检验专业获学士学位。 1998年 7月,在重 庆医科大学临床检验诊断学专业获硕士学位。 2004年 7月,获得同一专业博士学位。

研究工作简历 研究工作简历::曾独立主持和参与多项科研项目:① 2007,2-至今,主持重庆医科 大学校级课题“核仁磷酸蛋白基因失调在白血病发生中的作用” ,进展顺利;② 2005,9-至今,主持重庆市教委科学技术研究项目 “ 探索高致瘤性 K562细胞系的白血病干细 胞表型 ” (No :KJ050309 ,进展顺利;③ 2005,1-2007,1期间,主持重庆医科大学博士 启动课题“ VEGF 反义寡核苷酸抗白血病血管新生和增强白血病源 DC 免疫功能的研 究” ,已结题;④ 2006,1-2008,1期间,作为主研参加项目组成员陈辉主持的重庆市卫 生局科研课题 “荧光定量 PCR 动态检测外周血循环 hTERT 用于肝癌诊断与预后的研究” (No :05-2-125 ,已经结题;⑤ 2000.12-2003.12期间,主持课题“脐血 CD3AK 细胞 联合 DC 体外抗肿瘤活性的研究” (重庆市卫生局青年人才基金资助项目 No :003003 , 已经结题; ⑥ 1999.2-2002.12 期间, 参加课题 “基因修饰的 DC 细胞抗 HBV 的研究” (国 家自然科学基金面上项目 No :39970673 ,已结题。

近期发表与本项目相关的学术论文 近期发表与本项目相关的学术论文::

(1 骆展鹏,何鹏,张伶 张伶

张伶,杨松,钟晓明,高玉洁. 核磷蛋白 A 型突变体对髓性白血 病细胞系增殖的影响. 临床检验杂志,2008;26(1:20-23.

(2 骆展鹏,张伶 张伶 张伶. 核仁磷酸蛋白突变与血液肿瘤.

中国实验血液学杂志,2007;15(3 :662-666.

(3 张伶 张伶

张伶,李唯,涂植光. VEGF对白血病树突状细胞抗原提呈能力的影响. 第三军医 大学学报,2007;29(16:1587-1590.

(4 张伶 张伶 张伶, 陈辉, 涂植光 . 人髓性白血病细胞 VEGF 及其受体的检测. 临床检验杂志,

2005; 23(5 :328-332.

(5 张伶 张伶

张伶,涂植光,冯文莉. VEGF反义寡核苷酸抑制人白血病细胞血管内皮生长因子 的表达.中华血液学杂志,2004;25(1:22-25.

(6 张伶 张伶

张伶,涂植光,冯文莉 . 造血生长因子对脐血单个核细胞的体外增殖效应.第四 军医大学学报, 2003; 24(12:1075-1077.

待发表 待发表与本项目相关的学术论文 与本项目相关的学术论文 与本项目相关的学术论文::

(1 何鹏,骆展鹏,张伶

张伶

张伶,杨松,钟晓明,高玉洁 . RNAi重组体抑制白血病 K562细 胞系中 NPM1基因的表达 . 第三军医大学学报, 2008;第 11期待刊 .

(2 何鹏,张伶

张伶

张伶,骆展鹏,杨松,钟晓明 . 急性髓系白血病 NPM 基因及突变检测方法 的建立 . 中国实验血液学杂志, 2008;第 4期待刊 .

在本项目中承担的任务

在本项目中承担的任务:

:承担整个课题的设计、组织实施、实验数据收集、整理、 统计,同时指导并参与项目实施过程中的各个实验环节。

3.2 项目组主要成员

项目组主要成员简历

简历

王利

王利,女, 1973年 2月出生,博士,主治医师。 1994年本科毕业于重庆医科大学 医学系, 在重庆医科大学临床学院血液科从事临床、 科研和教学工作。 2001年获该校内 科学硕士学位, 2004年获内科学博士学位。 2002年到英国牛津大学做访问学者, 2005年至今在英国牛津大学分子血液学实验室做博士后研究,将于 2008年底回重庆医科大 学 。 主 要 研 究 方 向 为 血 液 肿 瘤 发 病 的 分 子 机 制 。 在 国 外 的 研 究 课 题 涉 及 到 血液肿瘤细胞生物学特性研究和 病毒载体构建及转染技术, 曾参与国家杰出青年科学基 金(39725012等多项科研项目。近期发表与本项目相关的学术论文有:

① Pellagatti A, Cazzola M, Giagounidis AAN., Malcovati L, Porta MGD, Killick S,. Campbell LJ, Li Wang,. Langford CF, Fidler C, Oscier D, Aul C,. Wainscoat JS, Boultwood J . Gene expression profiles of CD34+ cells in myelodysplastic syndromes: involvement of interferon stimulated genes and correlation to FAB subtype and karyotype. Blood , 2006;108(1:337-345.

② Li Wang , Fidler C, Giagounidis AAN, Cazzola M, Malcovati L, Killick S, Aul C, Boultwood J, Wainscoat JS. Genome-wide analysis of copy number change and loss of heterozygosity in myelodysplastic syndrome with del(5q using high-density SNP arrays. Haematologica (Accepted.

③ Li Wang, Chengwei Tang et al. Association between vasoactive intestinal polypeptide and the shift of hematopoiesis from fetal liver to bone marrow of rats during development. Dev Biol (submitted

④王利

王利

王利,唐承薇,王春晖,李献,强欧,黄明慧 . VIP 对人脐血 CD34+细胞向肝系分化 的影响初探 . 四川大学学报(医学版 , 2006; 37(4:578-582.

⑤王利

王利

王利,唐承薇,王春晖,李献 . 发育过程中肝脏血管活性肠肽及其受体量的变化 . 生理

学报, 2005; 57(3:379-383

在本项目中承担的任务 在本项目中承担的任务::提供临床医学与检验医学的合作,帮助从理论并结合临床 资料解释实验结果,重点负责指导构建病毒载体,协助国际学术的交流。

陈辉 陈辉::男, 1970年 3月出生,博士,副教授,硕士研究生导师。 1998年 7月,在 华西医科大学生物化学专业获硕士学位; 2004年 7月, 在重庆医科大学临床检验诊断学 专业获博士学位。 一直从事重大疾病发病机理与预防方面的研究。 2001~2004年, 以第 一主研身份参与并完成教育部重点课题:钙通道阻滞剂对自发性高血压大鼠左室心肌重 塑的作用及分子机理研究; 2004~2007年, 以主研的身份参与并完成了国家自然科学基 金的研究 “中国家蝇抗菌肽分子结构和抗菌机制的研究” (No :30472106 ; 2005-2007年负责并完成重庆市卫生局科研课题 “特异抑制 CHP2选择性酸化治疗肝癌的实验研究” (No :04-2-155 。 2006年以项目负责人身份获得重庆市卫生局资助科研项目“荧光定 量 PCR 动态检测外周血循环 hTERT 用于肝癌诊断与预后判断的研究”

(No :05-2-125 。 在本项目中承担的任务 在本项目中承担的任务::负责荧光定量 PCR 检测目的基因表达。

4、承担科研项目情况 承担科研项目情况

4.1申请人主持的科研项目

① 2007,2-至今主持重庆医科大学校级课题 “核仁磷酸蛋白基因失调在白血病发生中的 作用” ,进展顺利。

② 2005,9-至今主持重庆市教委科学技术研究项目“探索高致瘤性 K562细胞系的白血 病干细胞表型” (No :KJ050309 ,课题已经完成, 2008年中旬将结题。 4.2 申请人及项目组成员参与的科研项目

①王利 王利 王利参加了英国 Leukemia Research Fund 资助的项目 “Acquired Uniparental Disomy in the 5q- Syndrome and Myelodysplastic Syndromes”,目前执行情况良好,已发表 论文一篇。

②张伶 张伶 张伶参加了项目组成员陈辉 陈辉 陈辉主持的重庆市卫生局科研项目“荧光定量 PCR 动态检测 外周血循环 hTERT 用于肝癌诊断与预后的研究” (No :05-2-125 , 进展顺利, 将于 2008年内结题。

(三 经费申请说明

经费申请说明 1. 本课题的申请经费管理严格按照 《国家自然科学基金经费管理办法》 (财教 [2002]65号执行,由研究经费、国际合作与交流经费、劳务费和管理费组成。具体支出如下:

①研究经费:26.875万元,占项目总经费的 83%,直接用于项目研究。包括科研业务费 和实验材料费共 25.675万元,占研究经费的 96%,余下经费为协作费。

科研业务费:4.2万元, 其中检测分析费占 48%, 调研、 会议交流以及出版费占 36%, 其余由能源动力费组成。

实验材料费:21.475万元,其中试剂药品费 20.5万元,用于购买 Ambion 生物公司 和 BD 公司的逆转录病毒载体以及美国 ATCC 购买白血病细胞系等实验关键材料。购买 细胞培养基和胎牛血清等实验消耗品;其它支出 0.975万元用于购买耗材等。

②国际合作与交流费:1.5万元,占项目总经费的 4.6%,主要用于研究成果的国际交流。 符合 NSFC 国际合作与交流经费≤ 15%之规定。

③劳务费:2.5万元,约占项目总经费的 7.7%,主要用于支付研究生和临时佣工的劳务 费(共 3年,在基金委规定的 15%范围内。

④管理费:1.625万元,占 5.0%,符合学校科研管理费=5%的规定。 以上预算符合基金委的相关要求 以上预算符合基金委的相关要求, , 详见经费预算表 详见经费预算表。 。

(四 其他附件清单

课题组成员海外成员王利(Li Wang的确认函件。

申 请 者:张伶 依托单位:重庆医科大学 项目名称:检测 NPM 基因突变并探讨 NPM 对白血病细胞生物学特性的影响 资助类别:面上项目 亚类说明: 附注说明:

申请者承诺 申请者承诺::

我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助,我将履行项目负责人职责,严格遵守国家自 然科学基金委员会的有关规定,切实保证研究工作时间,认真开展工作,按时报送有关材料。若填 报失实和违反规定,本人将承担全部责任。

签字:

项目组主要成员承诺

项目组主要成员承诺: 我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助,我将严格遵守国家自然科学基金委员会的

有关规定,切实保证研究工作时间,加强合作、信息资源共享,认真开展工作,及时向项目负责人 报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定,本人将承担相关责任。 编号 姓 名 工作单位名称

项目分工 每 年 工 作 时 间 (月 签 字

1 王利 University of Oxford 课 题 指 导 和 临床支持 6 2 陈辉 重庆医科大学 检 测 方 法 学 评价

5 3 骆展鹏 重庆医科大学 检测 NPM 突基 因表达 10 4 何鹏 重庆医科大学 病 毒 载 体 构 建及转染 10 5 钟晓明 重庆医科大学 单 抗 制 备 及 免疫学检测 10 6 杨松 重庆医科大学 FCM 检测和趋 化实验 10 7 王箭 重庆医科大学 实 验 技 术 指 导

8 8 高玉洁 重庆医科大学 细 胞 生 物 学 特性检测 10 9

依托单位及合作单位承诺 依托单位及合作单位承诺::

已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助,我单位保证对研 究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障,严格遵守国家自然科学基金委员会有 关规定,督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规 定及时报送有关材料。

依托单位公章 合作单位公章 1 合作单位公章 2

日期: 日期: 日期:

国家自然科学基金标书