PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变

发布时间：2023-03-15 02:02:45

・３２８・　临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１４　Ｍａｒ；３０（３）　网络出版时间：２０１４—３—２５　１３：０６　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／ｌＯ．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１４．０３．０２８．ｈｔｍｌ　ＰＣＲ直接测序法与ＡＲＭＳ检测ｔｉｅｄ，细胞肺癌ＥＧＦＲ基因突变　宿杰阿克苏。，侯英勇　，刘亚岚　，徐摘要：目的晨　，张新　，黄　洁　１材料与方法　比较ＰＣＲ直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突　变系统（ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）检测　非小细胞肺癌（ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）中ＥＧＦＲ　基因突变的敏感性。方法用直接测序发与ＡＲＭＳ法同时　检测１５４例ＮＳＣＬＣ中ＥＧＦＲ基因第１８、１９、２０、２１外显子的　突变情况。结果男性８４例，女性７０例，年龄３３～８６岁，　手术切除标本７１例、活检标本７９例，其中鳞状细胞癌２７　例、腺癌１２１例、腺鳞癌２例；另４例为胸水。测序法３２例　突变（３２／１５４，２０．８％），ＡＲＭＳ法５２例突变（５３／１５４，３３．　８％）。两种方法均检测到突变者２９例，均无突变者９９例，　直接测序法检测到突变而ＡＲＭＳ法阴性者３例，反之２３例，　不一致率差异有显著性（Ｐ＜０．０００　１）。结论检测ＮＳＣＬＣ　中ＥＧＦＲ突变情况时，ＡＲＭＳ法较直接测序法操作步骤少，　突变率高。　关键词：肺肿瘤；非小细胞肺癌；基因突变；测序；蝎形探针扩　增阻滞突变系统　中图分类号：Ｒ　７３４；Ｒ　４４６　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００１—７３９９（２０１４）０３—０３２８—０５　ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１４．０３．０２８　肺癌是全球病死率较高的恶性肿瘤之一。近年，以易瑞　沙（ｉｒｅｓｓａ）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂　（ＥＧＦＲ—ＴＫＩ）在非小细胞肺癌（ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，　ＮＳＣＬＣ）的治疗中取得了很好的疗效　Ｊ。进一步的研究发　现，ＮＳＣＬＣ的人群选择性和ＥＧＦＲ—ＴＫ区域的基因突变有　关　’　。不同位点突变的生物学功能不同，例如，ＥＧＦＲ１９外　显子和２ｌ外显子突变型ＮＳＣＬＣ对ＥＧＦＲ—ＴＫＩｓ有良好的反　应性，而２０外显子点突变时形成ＥＧＦＲ—ＴＫＩｓ继发性耐药的　重要机制之一　。临床治疗指南中已明确规定在采用易瑞　沙治疗前需检测ＥＧＦＲ基因有无突变，因此，ＥＧＦＲ基因突　变检测的准确性显得非常重要。已发展起来的用于基因检　测的方法多种多样，本文比较经典ＰＣＲ扩增一直接测序法　（以下简称直接测序法）和蝎形探针扩增阻滞突变系统（ａｌｎ—　ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）在检测ＮＳＣＬＣ　的ＥＧＦＲ基因突变中的价值。　收稿日期：２０１４—０１—１０　作者单位：复旦大学附属中山医院　病理科、　肺科，上海２０００３２　作者简介：宿杰阿克苏，女，主管技师。Ｔｅｌ：（０２１）６４０４１９９０－２７３２，　Ｅ—ｍａｉｌ：ａｋｓｓｈｕｊｉｅ＠１２６．ｃｏｒｎ　黄洁，女，硕士，技师，通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｊｉｅｌ１１６　＠】６３．ｃｏｒｎ　１．１一般资料选取复旦大学附属中山医院病理科２０１０　年１０月～２０１１年３月行ＥＧＦＲ检测的患者１５４例，同时进　行测序法和ＡＲＭＳ法检测。其中６５例为回顾性病例，均为　测序法判断为无突变者；８９例为前瞻性病例。手术切除标　本７１例，各种活检标本７９例，包括纤维支气管镜活检、肺穿　刺、淋巴结活检、胸膜活检等；另４例为胸水。　１．２直接测序法　检测ＥＧＦＲ基因第１８、１９、２０、２１外显　子。从石蜡包埋组织或新鲜细胞（胸水）中提取ＤＮＡ，ＰＣＲ　扩增３５个循环，退火温度６２℃。反应所需引物序列如下：　第１８号上游引物５　一ＧＡＧＧＴＧＡｃｃｃＴＴＧＴｃＴｃＴＧＴＧＴ．．３，下游　引物５　一ＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡ一３　，特异扩增第１８　外显子２４５　ｂｐ；１９号上游引物５　一ＴＧＣＣＡＧＴＹＡＡＣＧＴＣＴＦＣＣＴ—　ＴＣＴ－３　，下游弓Ｉ物５　一ＴＧＡＡｃＡｒｒＩＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴ一３　，扩　增１９号外显子１９５　ｂｐ；２０号上游引物５　－Ａｃ　ｒＩＴＩ’ｃＡｃＡＧＣｃＣＴ—　ＧＣＧＴＡＡＡＣ一３　，下游弓Ｉ物５　一ＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴ兀’（　一　３　，扩增２０号外显子５１３　ｂｐ；２１号上游引物５　一ＧＡＧＣＴｒＣＴ—　ＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴ．．３，下游引物５，＿ＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣ—　ＣＴＡＡＡＧ．．３，扩增１１号外显子１９９　ｂｐ，引物由上海生物公司　合成。ＰＣＲ产物经纯化（ＡＸＹＧＥＮ纯化试剂盒）后及测序反　应（ＡＢＩ　ＢｉｇＤｙｅ　３．试剂盒）后，用ＡＢＩ３７３０型测序仪测序，所　得结果与基因库ＥＧＦＲ基因序列核对。所有病例均经正向　及反向测序。　１．３　ＡＲＭＳ法选择厦门艾德公司研发的人类ＥＧＦＲ基因　２９种突变检测试剂盒（ＡＲＭＳ法），具体步骤按照操作指南　进行。　２结果　２．１　ＮＳＣＬＣ临床病理学特征本组１５４例ＮＳＣＬＣ中，男　性８４例，女性７０例，年龄３３—８６岁。手术切除标本７ｌ例，　活检标本７９例，另４例为胸水。活检标本中包括纤维支气　管镜４７例，肺穿刺１０例，其余为淋巴结活检或穿刺、胸膜活　检、骨髓穿刺等。所有患者检测前均未行伊瑞沙治疗。肿瘤　组织学分类为鳞状细胞癌２７例、腺癌１２１例、腺鳞癌２例，４　例胸水无组织学类型。　２．２直接测序法检测１５４例ＮＳＣＬＣ中检测到３２例突变，　突变率为２０．８％。其中回顾性病例６５例均为测序无突变　者，因此在８９例前瞻性病例中，测序法检测到ＥＧＦＲ突变率　为４０．０％。其中单个位点突变者３１例，包括１４例１９外显　子缺失突变（图１）、１例２０外显子７７４位点ＣＡＣ插入突变、　


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