深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展
发布时间：2020-12-25
深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展
我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得[1]。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。本文主要是对目前新一代DNA测序（也叫深度测序）技术（Next-generation DNA sequencing technologies）的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述[2，3]。 从上世纪九十年代早期开始，几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的 [4]。这种方法首先要对DNA预处理，获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应，这个过程会产生大量长短不一，末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，利用计算机软件自动“读出”DNA序列。这种方法可以应用于序列分析，这种高通量的测序方法一般可以同时进行96或者384个样品的测定[5]。各种不同的DNA测序策略可以被归为以下四类：a.微电泳方法，b.杂交法，c.单个分子的实时观测测序法，d.循环阵列测序法。循环阵列测序法可以简单的描述为：对充满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应操作和碱基成像数据收集。由于这种方法相对于传统的测序方法速度更快，成本更低，因此，在之后的几年中，这种方法被人们广泛的应用[6-8]。这些方法的共同点就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物在空间上都是聚集的：桥式PCR和原位polony测序法中的产物都是集中在平板的某处，而Emulsion PCR的产物则集中在微珠的表面[9-11]。 454测序仪的优点在于：解决了高通量测序的问题，缩小了测序反应的体积，降低了试剂的使用量，因此，这种测序方法成本相对传统测序法是极其低廉的。454测序仪技术是继Sanger测序技术之后出现的第一个用于对细菌基因组进行从头测序的新技术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非Sanger测序技术[12]。它的特点是对于检测同聚物来说，Illumina 测序仪要比454测序仪好很多，平均出错率是1%-1.5%，AB SOLiD测序仪可以将富集有模板片段的微珠进行高度可控的任意排列。AB SOLiD测序仪后期的合成测序法是由DNA连接酶完成的，并不像其他测序法一样，是由DNA聚合酶完成的。AB SOLiD测序仪还有一个特点，即运用了双碱基编码技术，这种技术可以校准误差，因为它是用两个碱基来对应一个荧光，因此，出错的概率会大大降低。Heliscope测序仪是一种循环芯片测序设备。这个平台的最独特的地方在于它不需要扩增DNA模板。他利用了高灵敏度的荧光探测仪直接对单链DNA模板进行合成法测序。首先是将基因组DNA进行随机切割，形成小片段DNA并在其尾部添加一个Poly-A（没有用PCR扩增），再通过Poly-A与Poly-T相互作用从而将待测模板固定在芯片上，制成测序芯片。纳米孔测序技术采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于其直径极小，仅能使单个核酸聚合物通过。其对已1000bp的单链DNA分子，RNA分子都无需进行标记或扩增。这使得快速廉价的进行测序成为可能。 参考文献：
[1]Mardis，E.R."Next-generation DNA sequencing methods." Annu Rev Genomics Hum Genet，2008，9：387-402.
[2]MacLean，D.，J.D.Jones，et al."Application of 'next-generation' sequencing technologies to microbial genetics." Nat Rev Microbiol，2009，7（4）：287-296.
[3]Morozova，O.，M.Hirst，et al."Applications of new sequencing technologies for transcriptome analysis." Annu Rev Genomics Hum Genet，2009，10：135-151.
[4]Metzker，M.L."Sequencing technologies - the next generation." Nat Rev Genet，2010，11（1）：31-46.
[5]Ansorge，W.J."Next-generation DNA sequencing techniques." N Biotechnol，2009，25（4）：195-203.
[6]Treffer，R.and V.Deckert."Recent advances in single-molecule sequencing." Curr Opin Biotechnol，2010，21（1）：4-11.
[7]Xu，M.，D.Fujita，et al."Perspectives and challenges of emerging single-molecule DNA sequencing technologies." Small，2009，5（23）：2638-2649.
[8]Branton，D.，D.W.Deamer，et al."The potential and challenges of nanopore sequencing." Nat Biotechnol，
