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BAC及其转基因研究进展

来自: 小蜉2007-09-29 19:09:17

BAC及其转基因研究进展
胡 炜 朱作言
(中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉 10087)

摘要：奉文综述了细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromsomes，BAC)的构建、物理图谱制作方法及其靶位精细操作策略的研究进展 同时，简要介绍了BAC转基因在基因功能以及基因表达与调控研究中的应用。
关键词： 细菌人工染色体 转基因

利用转基因动物可有效地研究基因的表达调控及其功能。增强子，座位控制区(MR)及insulators等调控元件对于转基因的高水平组织特异表达和整合十分重要，但这些调控元件常距基因约50kb之遥 。 传统上，由于受DNA克隆载体容量的限制，制作转基因动物的外源基因片段通常小于20kb，因此某些调控基因活性的重要元素不可避免地被丢失，从而导致转基因的低水平表达及位置效应的产生 。人工染色体技术的建立和不断发展，为大基因和太基因簇的转基因研究提供了技术准备。
1987年，克隆容量可达几百至几千kb的酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosomes，YAC)问世 ，并可以通过同源重组的方式在酵母菌中对携带有基因组插人大片段的YAC进行操作，这些操作包括高效地引入报告基因、特定的缺失突变等 ，鉴于YAC转基因技术不仅保证巨大基因的完整性，保证所有顺式因子的完整并与结构基因的位置关系不变，而且目的基因上下游的侧翼序列可以作为缓冲区域，消除或减弱基因整台后的“位置效应”，使外源基因的表达更接近于真实情况，并为研究基因的功能提供便利。为此，几个研究小组在YAC诞生之始即致力于建立YAC转基因技术。1993年，Schedl等首次报道用显微注射法制备得到含35kb酪氨酸酶基因以及侧翼序列的转基因鼠，并在后代中检测到酪氨酸酶的表达 。同年，Yale大学医学院Forget教授随即在美国科学院院刊上以“YAC transgenes：
bigger is probably better”为题发表述评，对这类大片段的转基因研究给予了高度评价。遗憾的是， YAC内部存在嵌合及重组等现象，即在一个YAC克隆里含有两个本来不相连的独立片段；某些克隆不稳定，在转代培养时可能会缺失或重排其中的片段 ；此外，由于YAC与酵母染色体具有相似的
结构，因此YAC很难与酵母染色体区分开，并且在转基因操作时必须特别小心，否则将难以保持YAC DNA的结构完整，进而导致大片段转基因研究失败。上述不足极大地制约了以YAC为基础的大基因和大基因簇的转基因研究。
1992年，shizuya等构建出细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromsomes，BAC)，尽管BAC克隆容量(350 kb)较YAC小，却具有许多YAC所不可比拟的特点。BAC的复制子来源于单拷贝质粒F因子，故BAC在宿主菌内只有极少数拷贝数，可稳定遗传，无缺失，重组和嵌合现象。BAC以E-coli为宿主，转化效率较高，常规方法(碱裂解)即可分离BAC：蓝白斑，抗生素，菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选；而且．可对克隆在BAC的DNA直接测序等等 。上述特点使得BAC与YAC系统相得益彰，从植物到小鼠乃至人类系统都得到广泛应用 ，成为目前转基因研究的热点和发展方向之一，并极可能在人类基因组及其后基因组计划中发挥巨大作用。为此，本文对BAC及其转基因研究进展作一简要综述。

l BAC的构建及其发展

BAC构建的基础是E．coil及F因子。研究表明，F因子在E coli中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞单拷贝或两个拷贝，此外，F因子具有携带1Mb插入片段的潜能，这就使得以此为基础、构建具有大容量克隆能力的BAC载体成为可能 。 1989年，O’Connor等首次用“染色体建造”的方法，利用F因子构建载体pMBO131来克隆大片段DNA。3年后，以pMBO131载体为基础，Shizuya等将T7、SP6启动子序列，含cosN及loxP位点的 噬菌体和P1噬菌体片段分别引入pMBO131载体，首次构建DNA 插人片段达300bp以上的DBACIO8L载体，该载体即使传代100代后，仍可稳定遗传，尚未检出缺失，重组及嵌合现象。第一代BAC载体的选择标志基因为氯霉素抗性基因，为进一步方便克隆的筛选，许多在常规质粒载体中已成熟使用的选择性标志基因纷纷被引人第一代BAC载体。1997年，Mejfa将8半乳糖甘酶LacZ基因及抗新霉素ne0基因插人pBAC108L载体，转染人类fibrosarcoma细胞系，在含x-gal、IPTG的的平板上生长48hr后，出现4．5％ ～10％的蓝色细胞；在G418存在下培养10天，直径为lOcm的培养皿中出现10～20个抗性克隆 ；同年，Baker构建了含荧光素酶或绿色荧光蛋白GFP的BAC载体，以此载体克隆7O-170kb的人类基因组DNA并转染HeLa细胞和成纤维细胞后，便利地筛选出表达GFP的克隆 。至此，具有快速筛选克隆能力的第二代BAC载体业已构建完成。

2 BAC物理图谱

构建高精细的人类基因组物理图谱是BAC产生的原动力。1996年，Wang等分别采用杂交(hybridization)，顺序标志位点(sequence—tagged site，STS)PER和指纹法(fingerprinting)等三种不同方式，绘制了人类染色体外630kb的amplisome结构的物理图，与long—ranEe restriction法所得到的图谱相一致 。同年．Somkin提出了多重引物的长片段高保真PCR(mulfplex long accurate PCR，MLA PCR)和YAC克隆相结合构建BAC物理图谱的方法。首先通过对克隆在M13噬菌体中较短的YAC克隆进行鸟枪测序，获得一定数量的重叠群(contig)，然后依据重叠群末端序列设计引物，经长片段高保真PCR排序。两重叠群间的缺口通过对PCR产物测序予以封闭。采用该策略，作者得到了>lOOkb的具有高分辨率的Bacillus 5Ⅱbtgis rrnB-dnaB区域图谱，与常规PCR相比，采用MLA PCR大大减少了完成某一BAC作图所需的反应数，但是，MLA PCR的产物间会出现相互干扰而影响克隆片断重叠群的定位，因此MLAPCR尚不成熟，其条件需进一步优化 。
最近，Herring等设计了一种谓之“载体一Hexamer PCR”的巧妙策略，利用该策略可以迅速有效地从YAC、BAC库中分离每个插人克隆的末端 。载体-Hexamer PCR以Restriction—site P C R 和Degener-ate OligonucleotidePrimed(DOP)一PCR 为基础发展而来，其巧妙之处在于引物的设计和使用上。上游引物为载体臂上的一系列嵌套引物，在T7启动子序列的3 端添加某一限制性酶识别的6 mer的序列即构成其下游引物，l1启动子序列在此作为锚定序列而发挥作用。第一轮PCR反应先在较低的退火温度(35℃)条件下，进行若干次循环(5次)，此时下游引物中只有3 端的6 mer序列执行引物功能；然后立即提高退火温度至5O或∞ ℃，继续进行25次循环，此时锚定序列与前5次PCR反应产物结合，引物功能转由完整的下游引物完成 随后，以第一轮PCR反应产物为模板，以载体臂上第二个嵌套引物为正向引物进行下一轮套式PCR反应。依此，再进行下一轮套式PCR反应，直至插入片段末端被分离(图1)。采用上述策略，Herring等分离了pBe—IoBAC11载体中l4个BAC克隆的全部28末端及小鼠 YAC库中的所有重叠群。“载体一Hexamer PCR”策略的精髓为纯粹PCR技术的巧妙应用，不需要适配子、连接子，毋需进行连接反应等．是目前进行BAC和YAC库末端克隆的较为理想的一种策略。

3 BAC靶位基因操作

能否对BAC靶位基因进行精细操作，是BAC系统可否成为研究基因功能和表达调控重要工具的前提之一。可喜的是，许多学者已对此进行了成功的探索。
由于难以寻找适宜的酶切位点，在BAC系统进行大片段DNA的限制性酶切操作就变得尤为困难。
1996年，Bor6n等设计了一种ReeA蛋白质辅助的限制性酶切(ReeA—assisted restriction endonuc]ease clear．age，RARE)操作方法。利用RARE操作，作者不仅完成了基因组DNA特异序列的切除，定点突变及缺失的引入，而且将人类基因组BAC库中较小的两个BAC克隆融合，形成160kb的含92kbLRP．1基因的新的BAC克隆，对这一操作，作者形象地称之为“BAC婚配(BAC marriage)” 。1997年，Yang等以靶位修饰法(Targeted modification of BAC)在重组缺陷型的E coii宿主菌中实现了BAC的定点修饰 。靶位修饰法的关键在于温度敏感型同源重组质粒的使用，温度敏感型质粒的特点是：当细胞在30℃培养时正常复制，而若温度上升为42．44℃ 时复制停止 。在该重组修饰体系中，BAC宿主为RecA缺陷，在对BAC修饰时依次将E．coii RecA基因和靶位基因的两同源区(均为500bp以上)引入温度敏感型质粒，再将此载体转化含BAC的E coil，分别经30℃ ，43℃ 两种不同温度培养，结合抗生素抗性和Southern 分析得到同源重组修饰的BAC克隆。
不可否认的是，前述两种靶位基因操作策略都存在一定的局限性，RecA辅助的限制性酶切无法避免基因组片段的分离、连接等有可能破坏大片段DNA完整性的操作；打靶修饰法则要求拥有基因组插入片段序列资料，否则无法构建打靶载体。为此，Kim等于1998年建立Cre．]oxP位点特异性重组修饰策略 。Cre．1oxP系统由Cre和loxP两部分组成，loxP是发生重组的特定位点，由两个13-bp的反向重复序列中间隔以8一b口的间隔区域构成的共34．b的序 列 ( 5 ．ATAACTI"CGTATAG．cATAcATTATAcGAAGTrAT．3’)；Cre系催化loxp之间进行重组的酶。修饰的基因位于复制原点缺失但带有loxP位点的质粒载体RETRObac上，在Cre酶作用下，位点特异性重组在BACRETRObac载体的loxP位点之问发生(图2)，由于RETRObac只有整合进BAC才能在宿主菌中复制，因此避免了RET—RObac载体上的修饰基因背景对实验的影响，其优越性在保持大片段DNA的完整性和分析未知基因方面不言而喻。然而，Cre．1oxP介导的同源重组频率大约仅为0．024％ ，如此低的重组频率极大地限制了这一精细修饰策略的运用。如何提高同源重组频率已成为精细修饰BAC的当务之急。
RecA蛋白质催化的同源重组从原则上讲可以发生在DNA的任何同源序列之间。但在实际上某些序列中重组发生的频率要远高于其他序列，即DNA分子上存在重组机率较多的热点。研究表明，Chi位点(5 -GCTGGTGG．3 )是目前发现的主要的重组热点。E coli含有大约1000个Chi位点，亦即每五个基因就有一个Chi位点，这些Chi位点中很多在细菌的接合和转导过程中作为重组热点而刺激同源重组的发生 。1997年，Dabert和Smith研究发现，两个适当排列的Chi位点，其刺激同源重组的发生的几率是单个Chi位点作用的5O倍 。在此研究结果的鼓舞下，1998年，Jessen等构建了含有Chi位点和斑马鱼GATA一2基因的靶位操作载体，并在Chi位点作用下，精确地完成BAC库中GATA．2基因的靶位修饰，且BAC无任何额外的删除和重排发生。

4 BAC转基因研究

随着BAC靶位基因操作方法的建立和发展，有关BAC转基因的研究已见诸报道。由于BAC可以容纳大片段DNA，不仅包括编码区，而且还包含有内含子和调控区；此外，BAC携带的基因可以和各种酶类，转录因子等作用，遵守基因表达和复制机制，理论上和正常染色体上的基因相似，因此BAC转基因已成为目前研究基因的功能、时空调控和表达的有力工具。近年来，一种有趣的现象被人们发现，几乎生物体的各个层次上都存在一种以24hr为周期的节律调节，生物体通过这种“节律钟”调节从分子水平到个体水平各个层次上的生命活动 。尽管从生理和遗传两方面对此进行了大量研究，也取得一定进展，但遗憾的是，目前仅在果蝇和脉孢菌中克隆到产生此类节律所必需的3个候选基因 ，而哺乳类节律钟基因迄今仍未克隆，更遑论其在节律调节体系中的功用。节律调节产生的机理何在?仍是困扰着人们但又极富挑战性的一道难题。
1997年，Antoch等采用BAC转基因挽救(Transgenic BAC Res．cue)策略克隆并确证了鼠节律钟基因及其功能，由此不仅解释了节律钟的分子机理，而且打开了一崩进行基因功能研究的窗户，与基因剔除(gene knok．out)及基因定位克隆等盛行的基因功能研究战略有异曲同工之妙 。
BAC转基因不仅可以对候选基因直接进行功能研究，而且可以通过精确修饰BAC插人大片段DNA，在受体基因组中营造一种相对独立的“自然”环境(native environment)，由此研究“客观条件”下基因的表达与调控。RU49基因是在鼠小脑颗粒细胞群、脑的齿状回组织和嗅球中特异表达的zn指基因 一将LacZ置于RU49 10kb的启动子下游，通过常规转基因动物制作方法得到转基因小鼠，LacZ在其中的表达呈现出强烈的位置效应，它要么处于沉默状态不表达；要么仅在皮质层而不是在小脑中表达，或者只在小脑尾部表达而在齿状回组织和嗅球中不表达。为了克服上述问题，1997年，Yang等通
过同源重组，将IRES—LacZ标志基因定点插入BAC库中RU49基因的第一个编码外显子上，从而获得克隆片段为13lkb、含有RU49基因且引入了IRES—LacZ标志基因的BAC。经常规CaCI 法转化，扩增BAC，碱裂解制备得到DNA后，脉冲场电泳，杂交分析确证，修饰过程中，BAC没有出现重排和缺失等
异常现象，为保证BAC DNA的纯度及完整性，将制备得到的BAC DNA通过Sepharose cL_4B浓缩，并以高盐为保护剂配制注射液进行显微注射，制作转基因鼠。结果表明，在RU49驱动下，转基因鼠脑中LacZ的表达与内源表达模式非常吻合，即LacZ在小脑颗粒细胞群、脑的齿状回组织和嗅球中特异表达。
此外，作者首次检测到完整的BAC在转基因鼠与B6／CBA品系鼠杂交后代中的传递，而且．BAC在种系间的传递符合孟得尔遗传规律。
通过BAC转基因技术在模式生物斑马鱼中进行基因的表达研究也见诸报道。基于Chl序列能大大增加同源重组发生的机率，1998年，shuolJin实验室首次将Chi用于BAC靶位精细修饰。Jenssen等构建了一个高效、简捷的基因打靶载体，以同源重组热点chi序列在E．col中激动同源重组的发生，精确地用GFP报告基因取代斑马鱼BAC库中血液特异表达 基因的第一个编码外显子。显微注射制作BAC转基因斑马鱼。通过对活体转基因鱼中GFP这一直观表达产物的观察，获得了GATA驱动下的高精确的基因四维表达模式。在BAC转基因首建鱼中，GFP的表达率为45％ ，大太高于作者用传统质粒载体获得的首建转基因斑马鱼1—15％的GFP表达率，而且，GFP在BAC转基因斑马鱼血细胞中表达的特异性、及通过传统质粒载体制作转基因鱼所无法避免的嵌合性整合等均得到明显改善。

5 展望

BAC能容纳太片段DNA，比以前所用的Cosmld库等有更高的覆盖率，可以使连不上的重叠群连接起来，对克隆在BAC的DNA直接测序是目前进行人类基因组全序列分析最简单、便捷的策略之一。
此外，BAC操作简单，避免了YAC的嵌合及重组等不足 因此，尽管BAC的发展历史尚不足1O年，但随着研究的深入，BAC及其转基因技术将对在复杂系统里研究基因的表达与调控，对于人类基因组计划的完成以及后基因组计划基因功能鉴定等具有重要意义和广阔的应用前景。

来源：维普资源http://202.107.204.73/index.asp

推荐理由：

1、BAC克隆载体即克服了Cosmld载体的小容量的缺点，也克服了ＹＡＣ的重组和嵌合现象，BAC克隆容量350 kb，较YAC小，但是，BAC在宿主菌内可稳定遗传，无缺失，重组和嵌合现象；BAC转化效率较高；常规方法(碱裂解)即可分离BAC；蓝白斑，抗生素，菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选；而且．可对克隆在BAC的DNA直接测序等等。

　２、BAC克隆载体适用与遗传信息量较大的真核生物。包括各类动物和高等植物。

　３、由于BAC可以容纳大片段DNA，提高了覆盖率；BAC携带的基因可以与各种酶类，转录因子等作用；遗传性质稳定；操作简单等。这些优点使得BAC应用价值很高，前景可观。对克隆在BAC的DNA直接测序是目前进行人类基因组全序列分析最简单、便捷的策略之一。

　４、分子生物学技术在生物研究领域的所起的作用越来越大。PCR技术的发明，各种限制性内切酶的发现以及克隆载体功能的实现都极大程度地推进了生物研究领域的发展。通过构建基因文库来筛选鉴定某一特定基因已经不是什么高深技术了。

５、虽然，构建BAC文库技术已经成熟。但是，个人觉得，构建文库工作量相当大，后期的筛选工作也较繁杂。能够通过新的技术改进构建文库过程，减小工作量，提高效率，这些应该是每一个生物工作者所期望的。

６、此外，国内科研机构间应该在基因文库构建方面多展开合作，避免不必要的技术重复过程，达到最大程度上的资源共享。例如，由实力雄厚的公司或科研机构牵头，挑选合适模式生物进行全部测序，将加速和推进中国生物行业发展。中国有意实行“草鱼基因组计划”，这就是个不错的开始。

bac