男性不育实验诊断检测项目基本内容及意义

暨南大学医学院附属深圳市人民医院（518020，深圳） 刘瑜 何林

随着基础研究的深入，与男性不育相关实验检测项目愈来愈多，内容涉及形态学、免疫学、生物化学及分子生物学等多学科领域。在这些繁冗的检测项目中究竟哪些最具诊断价值以及如何正确运用这些检测项目来进行不育症的病因学诊断，是长期困扰男性不育实验诊断临床应用的技术难题。现将当今较为成熟、有良好应用价值并获得国际专家学者广泛认可的实验检测指标介绍如下：

一、静止性生殖道感染检测指标

精液中的泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞形态在湿片状态下是无法区分开的，它们统称为圆细胞（Round cells）。只有通过特殊检查才能将白细胞与其他类型圆细胞区别开，从而达到判断感染是否存在的目的。

精液白细胞过氧化物酶(Leukocyte Peroxidase)染色、精液白细胞群(Leukocyte subpopulations)定量和精浆弹性蛋白酶(Elastase)定量是目前用于精液感染性检测的常用指标。其中前二者是WHO推荐指标，后者是近几年被国内外学者广泛研究认可的检测指标。

精液白细胞过氧化物酶染色、精液白细胞群定量主要用于判断白细胞精子症，精液白细胞数大于1×106/ml即可确诊。但二者在诊断准确性上是有差别的。过氧化物酶染色只能检测到精液中分泌过氧化物酶的中性粒细胞，不能检出精液中所有白细胞，故假阴性率高。而白细胞群定量是迄今为止最准确可靠的白细胞精子症检测方法，可检测出精液中所有类型白细胞。

精浆弹性蛋白酶定量检测的是白细胞抗炎效应复合物。精液中弹性蛋白酶浓度与白细胞量不一定总是成正比。有研究表明，精液弹性蛋白酶浓度与精液中白细胞（过氧化物酶法检测）呈良好相关性。精液白细胞浓度>1×106/ml时，精浆弹性蛋白酶浓度均>1000ng/ml。但当精液白细胞浓度<1×106/ml时，亦有一些标本精浆弹性蛋白酶浓度>1000ng/ml[1]。最新研究表明，通过ROC(receiver operating characteristic)曲线分析，精浆弹性蛋白酶判定感染的临界值定为290ng/ml，其灵敏度为79.5%，特异性达74.4%[2]。

二、免疫性不育检测指标

目前血清抗精子抗体检测已在临床广泛开展。对于男性不育患者而言，以血清抗精子抗体作为免疫性不育辅助诊断指标并无多大临床意义，原因如下：（1） 由于男性血-睾屏障的存在，血清内精子抗体的存在无法真实反映当前生殖道内精子是否存在抗体；（2）血清抗精子抗体诊断试剂盒特异性较差。目前国内外所用血清抗精子抗体诊断抗原多直接从精子内获得，它同时包含精子膜抗原和大量精子膜内抗原物质。迄今为止已发现的人类精子特有抗原物质多达几十种（但尚不清楚引发免疫性不育最具特异性的抗原成份），这些提取抗原可与正常人血清存在明显的交叉反应。尽管在制作工艺上可使试剂盒最大限度地减少这种假阳性结果，但其特异性仍存在较大疑问；（3）该项目试剂盒检测方法多采用ELISA间接法，易造成假阳性。

精子膜表面抗体(Spermatozoan surface antibody)（亦称精子包被抗体, Antibody-coating of spermatozoa）是WHO推荐的用于免疫性不育的诊断指标。其优点在于：（1）检测标本为活力精子，更有临床意义；（2）可以对精子表面抗体产生部位进行定位；（3）检测过程中能保持被检测精子膜的完整性，膜内抗原不对外释放，检测更具特异性；（4）操作简单快捷。

临床上许多血清抗精子抗体检测结果呈阳性的男性，其精子包被抗体检测却并无异常。

三、前列腺分泌功能检测指标

1．精浆锌(Zinc)

WHO推荐指标。锌直接参与精子生成、成熟、激活和获能；能延缓精子膜的脂质氧化，维持胞膜结构的完整性和稳定性，从而使精子保持良好的活动力；锌是前列腺功能指标之一，与抗细菌感染有关。病原微生物感染对前列腺分泌功能有影响，可使精浆锌降低。

2．精浆柠檬酸(Citric acid)

WHO推荐指标。精浆柠檬酸来自前列腺，其作用是通过与钙离子结合，影响射精后精液液化过程。前列腺炎可导致精浆柠檬酸降低。

3．精浆酸性磷酸酶(Acid phosphatase )

WHO推荐指标。前列腺炎可引起精浆酸性磷酸酶降低，前列腺肥大或早期前列腺恶性肿瘤者其含量增高。

四、精囊分泌功能检测指标

精浆果糖(Fructose)是WHO推荐的精囊分泌功能评价指标。精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源。精囊炎时其含量降低；不完全射精或射精过频，果糖含量亦降低；精囊缺如果糖测定为阴性。常用于梗阻性无精症患者梗阻发生部位的定位诊断。

五、附囊分泌功能检测指标

精浆中性α-葡糖苷酶(Neutral alpha-glucosidase )是WHO推荐的附囊分泌功能评价指标。中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更特异更灵敏。结合激素和睾丸其他指标，对远端输精管阻塞有较好的诊断价值。

六、精子功能评价指标

1．去透明带仓鼠卵母细胞试验(Zone-free hamster oocyte test)

WHO推荐检测指标。用于精子-卵母细胞融合能力的体外评价。其不足之处在于：（1）该方法不如生理过程有效，而且可能涉及不同机制，常出现假阴性结果（病人的精子在仓鼠卵母细胞试验中失败，但在体内或体外可使人的卵母细胞受精）；（2）试验操作复杂，可变因素较多；（3）试验中难以实施有效的质量控制，试验误差较大，且仓鼠卵母细胞来源困难，普通实验室难以开展临床检测工作。

2．诱发顶体反应（Induced acrosome reaction, IAR）

WHO推荐研究指标。通过对引发顶体反应后的顶体状态进行评价，达到鉴定顶体反应障碍的目的。去透明带仓鼠卵母细胞试验中也包含有诱发顶体反应的过程，IAR作为一个独立的检测项目，主要用于男性不育病因分析及辅助生殖技术（ART）助孕方式的选择[3]。

3．精子顶体酶 (acrosin)

顶体酶是受精过程中重要的蛋白水解酶，当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。

精子顶体酶是目前被国内外学者广泛研究和认可的评价指标。虽然顶体酶的作用机制现在尚未完全明了且存在一定争议，精子顶体酶活性检测也暂未列入《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》，但其在辅助生殖中的意义已得到多数学者的承认，将其作为ART助孕方式选择的评价指标之一已获得良好的应用效果[3]。

4．人透明带结合试验（Human zona pellucida binding test）

WHO推荐研究指标。精子与透明带结合的过程启动顶体反应，释放可溶性顶体内容物，精子穿透透明带基质。当体外受精失败或成功率低时，评价与透明带结合的精子数可能具有临床价值。很少或没有精子结合在透有带上，通常提示精子有缺陷。但试验受到人卵母细胞来源的限制，且卵母细胞存在个体差异。

七、精子发生评价指标

1．血清抑制素B（Inhibin B）

以传统血激素指标FSH反映睾丸生精功能状态时，存在一定的误差。有时一些精子发生障碍的患者，其血清FSH水平的改变却不太明显。抑制素B可以反映Sertoli细胞的功能状态，也可以作为评判睾丸生精功能的指标。精子生成障碍越严重，抑制素B值越低。由于抑制素B为睾丸支持细胞直接产生，其分泌是由前一阶段精子发生刺激引起的，更能反映睾丸内精子发生的情况，而FSH受多因素影响。因此有人认为血清抑制素B是诊断精子发生障碍更直接、更有价值的指标。若将血清抑制素B和血清FSH检测结合起来，则将大大提高对睾丸生精功能了解的准确性[4]。

此外血清抑制素B还可用于非阻塞性无精症病人睾丸精子抽取的预测、青春期性腺功能的评估以及辅助生殖过程中卵巢储备功能的评价。

血清抑制素B对精子发生的评价功效，已得到WHO的认可[5]。

2．精液中凋亡生殖细胞检查（Apoptosis of spermatogenic cells）

非WHO推荐指标。细胞凋亡系统可能参与男性生殖细胞生成过程中的质量调控机制，而且与精子细胞和精母细胞阶段的生精阻滞有关。精子发生过程中，如遇到性激素降低、辐射、温度升高或毒物接触等情况，凋亡细胞尤其是调亡的原始精母细胞数目将增多。

特别是精液中脱落生殖细胞增多且精子数量或质量明显下降时，精液中生殖细胞凋亡检查更具临床意义。检测生殖细胞的凋亡对于男性不育症的临床诊疗、生殖系肿瘤的治疗与预后以及男性避孕药物的研究与开发具有重要意义。

3．遗传学检测指标

(1) 染色体核型分析

精子发生障碍常规检测项目，具有重要临床意义。

(2) 精子发生候选基因

迄今为止，除Y染色体无精子因子（Azoospermia factor, AZF）区域微小缺失外，其他与精子发生有关的染色体区域尚未被确定。大量不育症病例研究表明，不育症可能是一多基因决定疾病。AZF基因缺失可导致无精子症和严重的少精症。目前临床通常只能选取AZFa、AZFb、AZFc基因中的几个位点进行检测。

4．精子核蛋白组型转换（Spermatozoan Nucleoprotein Transition）

非WHO推荐指标。在正常睾丸精子发生过程中，精子核蛋白中与DNA结合的组蛋白逐渐被鱼精蛋白所取代，这个过程称为精子核蛋白组型转换。受精前精子基因在鱼精蛋白特殊保护下紧密浓集，抑制了精子基因表达，使遗传物质保持稳定。核蛋白组型转换缺陷或异常直接影响精子受精能力和受精后原核的形成及胚胎的发育，可引起不育或胚胎早期夭折流产。

八、其他评价指标

1．精子形态学（Sperm morphology）

WHO推荐检测指标。是了解精子质量状况最基本的检测指标，用于不育查因及ART助孕方式的选择。WHO新的技术规范不仅要求区分精子形态正常与异常百分率，同时对畸形精子分类进行了细化，即计算多重精子缺陷指数，增加了畸形精子指数(Teratozoospermia index, TZI)和精子畸形指数(Sperm deformity index, SDI)两个新指标。有研究表明，TZI>1.6与未经治疗不育夫妇的低生育率有关，而且SDI 1.6是体外受精失败的阈值[6]。

2．精子低渗膨胀试验（Sperm hypo-osmotic test, HOS）

WHO推荐检测指标。WHO不主张将HOS作为精子功能试验予以应用，认为它是一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法。而部分学者认为HOS可作为精子膜功能指标之一使用。有研究结果表明：HOS与去透明带仓鼠卵母细胞试验之间有较好的符合率，对继发性不育者更有价值。目前国内外学者将HOS作为ART助孕方式选择的一个评价指标加以应用[3]。

3．精子悬液活性氧类物质（Reactive oxygen species, ROS）

WHO推荐研究指标。ROS是氧的代谢产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧根、过氧化氢根和一氧化氮。当过量存在时，这些活性氧类物质通过诱发精子细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化而造成病理性损伤。人类射出的精液中，ROS是由精子和白细胞产生的。约40%不育门诊的男性患者和97%脊髓受到损伤的男性，在他们的精液中存在可测浓度的ROS[6]。

4．计算机辅助精子分析（Computer-aided sperm analysis, CASA）

WHO推荐检测方法。CASA较人工方法具有以下优点：（1）高精确性；（2）提供精子动力学的量化数据。

如何准确、自动识别精子是精子自动分析中的难题，目前CASA主要包括灰度识别和DNA荧光识别两种技术。DNA荧光染色分析技术可将精子分成绿色（活精子）和橙色（死精子），能更好地将精子与杂质区分开来，准确度优于灰度识别法，但荧光光源寿命短、检测成本增加是其主要缺点。

无论采取何种CASA技术，欲达到重复性好、准确度高的检测效果并非易事，需要遵循正确的操作步骤和足够细心。总的来说，精子密度检测是CASA的弱项，精子活动力检查则是CASA的长处。

人类对男性不育相关实验诊断指标的认识存在一个反复实践的过程，随着研究的不断深入，其内容也将逐步得以更新和完善。

关键词：男性不育；实验诊断

主要参考文献

1. Hans Wolff, Deborah J. Anderson. Evaluation of granulocyte elastase as a seminal plasma marker for leukocytospermia. Fertility and Sterility 50:129,1988

2. B. Zorn, I. Virant-Klun, H. Meden-Vrtovec. Semen granulocyte elastase:its relevance for the diagnosis and prognosis of silent genital tract inflammation. Human Reproduction 15(9):1948-1984,2000

3. Rajasingam S. Jeyendran. Interpretation of semem analysis results:A practical guilde. Cambridge university press, 2000

4. Pierik FH., Vreeburg JT., Stijnen T., et al. Serum inhibin B as a marker spermatogenesis. J Clin Endocrinol Metab 83(9):3110-3114,1998

5. Patrick J. Rowe, Frank H.Comhaire, Timothy B. Hargreave, et al. WHO manual for the standardized investigation, diagnosis and management of the infertile male. Cambridge university press, 2000

6. World health organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge university press, 1999

男性不育实验诊断检测项目基本内容及意义