1. 目的（PURPOSE）

规范药品质量检查方法的管理，确保药品所用无菌检验方法的可行性、检验结果的可靠性。

2. 适用范围（SCOPE）

适用于药品的无菌检验方法验证。

3. 职责（RESPONSIBILITY）

质量控制部微生物组负责

4. 关键词（KEY WORDS）

无

5. 定义（DEFINITION）

无

6. 程序（PROCEDURE）

6.1 验证的原理

6.1.1验证试验方案的设计需要满足两个方面的要求：

1）在检测前样品的预处理方式能有效抵消（或中和）产品中抑菌性；

2）样品的预处理方式和检测过程以及培养条件等均不会影响样品中的微生物生长。

6.1.2 对同类产品三个不同批号样品进行微生物挑战试验后，通过比较三批样品中挑战菌株的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。

6.2 验证试验用供试品的制备与检查

6.2.1 样品组（A组）：用适当的方法中和样品，再向其中接入少量的挑战微生物（接种量控制在10~100cfu之间），按照常规检测程序和培养条件检查挑战微生物的恢复生长情况。

6.2.2 蛋白胨对照组（B组）：除了用A溶液（0.1%蛋白胨溶液）替代实际样品外，中和方式、检测程序和培养条件等均与样品组（A组）相同。

6.2.3 阳性对照组（C组）：不经中和处理，将微生物挑战菌株直接接种于培养基培养，接种量与前两组相同，均在10~100cfu之间。

6.3 验证用挑战微生物

6.3.1用于验证试验的挑战微生物要具有广泛代表性，至少包括需气菌、厌氧菌、兼性菌等，所选用的菌株要基本上涵盖样品中可能存在的各类微生物。在验证中常选用的微生物有金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉等。

6.3.2 挑战微生物的培养条件及贮存条件需按《QC-6.2菌种管理》进行，以确保各代微生物细胞的生理状态保持稳定一致。

6.3.3验证时，选择的挑战微生物传代次数不应超过5代，并且详细记录所用菌株的来源、传代次数。

6.4菌种

6.4.1 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003或ATCC 6538]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [ CMCC(B) 63501或ATCC 6633]

大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B) 44102或ATCC 8739]

梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)[ CMCC(B) 64941或ATCC 19404]白色念珠菌(Candida albicans) [ CMCC(F) 98001或ATCC 10231]

黑曲霉(Aspergillus niger) [ CMCC(F) 98003或ATCC 16404]

6.4. 2菌液制备

(1)接种金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌的新鲜培养物至胰蛋白胨大豆琼脂培养基中, 接种梭状芽胞杆菌的新鲜培养物硫乙醇酸盐液体培养基（FTM）中，于32.5℃培养箱中，培养18～24小时。

(2)接种白色念珠菌新鲜培养物至胰蛋白胨大豆琼脂培养基中，于24.0℃培养箱中，培养24～48小时。

（3）接种黑曲霉新鲜培养物至胰蛋白胨大豆琼脂培养基中，于24.0℃培养箱中，培养5～7天。

(4)上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lmL含菌数为10～l00cfu的菌悬液；因此在制备菌液时，需要标定菌液浓度，可以采用麦氏比浊管比浊法或直接用平皿稀释法。

（5）其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、

和梭状芽胞杆菌接种于硫乙醇酸盐液体培养基（FTM）；而黑曲霉、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）。

6.5 验证试验条件

与药品无菌检查试验相同，可参照《QC-4.3无菌检查法》。

6.6 验证用的检查方法

无菌检查首选薄膜过滤法，若样品难过滤或不能用薄膜过滤法的情况下，可以采用直接接种法。

6.6.1 薄膜过滤法

6.6.1.1验证产品对薄膜过滤法的抑菌性与实际的无菌检查相同，在同一型号的滤筒内过滤规定量的供试品。若不能直接过滤的样品，可选择适宜的方法进行产品的预处理，即制备供试液。

6.6.1.2取一定量的冲洗液对滤膜进行冲洗，每次冲洗量不超过200ml，最多冲洗次数不超过5次。

6.6.1.3 在最后一次冲洗液中加入10~100cfu的挑战微生物，并将相应的培养基加入到装有滤膜的滤筒内。

6.6.1.4 将所选的挑战微生物逐一加到相应的培养基进行验证，并将装有培养基的滤筒置于适当的温度下培养，培养时间不超过7天。

6.6.1.5 可接受标准

1）如果样品组中培养基培养结果有明显的微生物生长，并且与阳性对照组的培养结果相似，则无菌检查试验中务必要过滤与验证相等量的产品、冲洗液，冲洗次数及使用等量的培养基。

2）如果与阳性对照组相比，样品组培养基内微生物生长现象不明显或不生长，说明该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可以增加冲洗液，更换滤膜并使用中和剂来重新进行验证。

3）如果已冲洗了5次，并且每次冲洗液体积达到500ml，仍无法中和滤膜上的残余抑菌性物质，那么在无菌检查试验中就采用此冲洗液体次数和冲洗量作为最终冲洗方法。

6.6.2 直接接种法

6.6.2.1 验证产品对直接接种法的抑菌性时，选择合适的挑战微生物。

6.6.2.2向每种无菌检查用的培养基内接入挑战微生物，每瓶的接种量控制在10～100cfu之间，参照《QC-6.2菌种管理》确定培养基用量。

6.6.2.3 按无菌检查要求，向含有微生物的培养基中接入规定量的供试品，另外留一瓶作为阳性对照。

6.6.2.4 将所选用的挑战微生物及相应的培养基逐一进行验证，并将培养基瓶（管）置于适当的温度下培养，培养时间不超过7天。

6.6.2.5 可接受标准

1）如果与阳性对照相比，样品组中有明显的生长现象，说明该方法可行，则在无菌检查试验中要与验证试验条件一致。

2）如果与阳性对照相比，样品组中微生物生长现象不明显，说明产品具有抑菌性。可使用吐温-80、卵磷脂、十四烷酸异丙酯等中和剂来消除抑菌效果。进行再验证。

3）如果中和剂不能消除抑菌作用，可适当增加培养基体积来消除抑菌作用。若培养基体积增加到2000ml仍无法消除抑菌作用，则在无菌试验中就使用2000ml培养基，但对医疗器械而言，可以据器械的具体体积来确定培养基用量。

6.7 验证结果评价

验证结束后，需要对整个方法验证的试验过程和结果分析进行评价。

6.7.1 对每种挑战菌株而言，每次验证试验数据的有效性和合理性。

6.7.2 验证试验数据说明，产品预处理方式、检验用器具、材料和培养条件等的合理性。

6.7.3 验证试验数据说明该产品的无菌检验方法准确、有效、可靠。

6.8 验证试验报告

按验证试验报告的统一格式进行填写。

7. 7.背景资料（BACKGROUND INFORMATION）

引用的SOP

reference SOP

《QC-4.3无菌检查法》

《QC-6.2菌种管理》

引用的参考文献

reference document

《中华人民共和国药典2005年版》增补版附录ⅪH 无菌检查法

《USP--31》

《中国药品检验标准操作规范2005年版》

8. 培训（TRAINING）

8.1培训对象（Trainees）： 质量控制部人员

8.2培训负责人(Trainer)：微生物主管

9. 产生文档（PRODUCED DOCUMENT）

无

10. 变更记录（CHANGE HISTORY）

无菌检验方法验证剖析