【转帖】冰冻切片技术介绍、制片技巧 冰冻包埋组织固定 冰冻切片免疫组化操作

各类组织实际操作技巧（连载补充） [精华]

切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。目前恒冷箱切片机的品种较多。此种切片适用于科研和教学上的连续切片。要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。二、。⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。⑸入固定明胶块1-2日。⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片可保存于10%甲醛液中。⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。先将果糖溶于麝香草酚饱和液，置于56℃温箱内12h，加明胶后在水浴内加温熔化，过滤后加钾矾。于100ml溶液内加甲醛2ml防腐。三、冰冻切片粘片法1．2．Lillie明胶粘片法将切片放入1%明胶水溶液数分钟，捞出置于载玻片上，将多余液体倾去。入5min,水洗10min，即可染色。3．乙醇明胶粘片法切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液（以40%乙醇配制）数分钟，捞于载片上，经室温短时干燥，入氯仿1min ,经95%及70%乙醇洗去氯仿，再经蒸馏水洗后染色。四、冰冻包埋液包埋切片 OCT Compound 法现在国内外有许多厂家用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘（chuck）上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。常规切片，厚度2-100微米。或者在盛标本的包埋模具内，挤出适量冰冻包埋液，放入组织块或细胞沉淀块，加包埋剂完全淹没组织块，如有气泡可用针头或吸头吸出。速冻：将盛有组织细胞和包埋液的模具，正置于切片机冷室内冰冻10分钟，至包埋液固化。也可将盛有组织的模具置于液氮或-40-70度冰箱冰冻固化保存，用前取出置于切片机冷室内平衡温度（否则损坏刀片）。

冰冻切片——组织块的准备1.调整好组织与刀片的方向这是冰冻切片准备中极为重要的方面，可以使这项工作变得简单，在我的工作中我总结出一些经验可供参考。a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不够，对绝大多数组织均合适的温度却切不好脂肪组织，如果一刀下去，组织中的脂肪先接触刀片，就会破碎并使整个片子损坏。如果脂肪最后接触刀片，则切片过程不受干扰。最糟糕的情况是脂肪部分先接触刀片而没有）的保护，可以给片子提供一个起始的缓冲，如果没有包埋，脂肪就会切碎并把整个片子破坏。当切片过程中由于脂肪的出现而影响质量时，我要么把摇柄转回去尽量避免，要么把脂肪挖出来。b.组织与刀片垂直或成角是关键。让我们假设组织由起始端、中间部分及末尾端三部分构成，起始端容易卷缩，或受到刷子的损害，还可能由于操作者的犹豫而引起片子的厚薄不均，这些都增加了假象的风险。末尾端在贴片时容易拉长，最好的是中间部分，最不可能出现假象，并且组织学上最干净，这是片子中最理想的部分。非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。成角包埋就像坐着船冲浪一样，如果你直线行驶，就会承受波浪线上最大的冲击，如果成角行驶，波浪线就会拉伸，所受的颠簸也会减小。跟公路上的减速脊一样的原理。上皮和粘膜贴附的组织如皮肤，胃肠，膀胱，子宫，颈部等，应当使上皮面垂直于刀片（见下图）。

2.组织块的温度任何组织都有一个理想的切片温度，在此温度下切片，组织片以平滑均一的形式流过刀片，几乎没有卷缩。当温度、组织类型、刀片均处于理想状态时，切片十分流畅，几乎不用刷子。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。如果需要加温，只需要把大拇指置于组织块面几秒钟；如果需要降温，可以使用机子的精确低温包埋系统，简单的做法就是把过冻的冻台放在组织面上几秒钟，大多数的冰冻切片机都有一种热吸收器可以使用。(2) 针头的移除在工作中经常会收到布满针头的标本，有时候针头会穿过整个组织，导致刀片的损坏并使片子一分为二，下面有一种简单的解决办法。

接到标本后快速冰冻。2、切片厚度6—7微米。3、切片完整，无污染，无皱褶。4、切片完成后立即固定。5、染液，脱水液必须及时更换。6、封固前必须经酒精脱水，。7、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。8、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚。9、制片工作一般应在15—20分钟内完成。10、冰冻报告后及时将“冰对”组织放入内。11、每天操作完成后，及时对机器进行清理和消毒。

（3）缝线的移除（4）挖凿的技术学会看片子这里指的是片子滑过刀片时就要辨别出质量的好坏，如果到镜下才发现片子的缺陷那就无法挽救。1.观察片子的厚薄，但人为辨别片子的厚度是否合适仍然很重要。片子太薄看起来象半透明的镜纸，片子太厚看起来混浊、柔性差，对我来说，5-6um的片子较合适，象一张薄的打印纸。3.片子上的条纹垂直于刀片的细条纹为刀片缺口所致，这往往是切到钙化组织、针头或缝线的结果。4.波浪线样的横皱

脂肪组织的处理1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织当我准备切淋巴结时，我会先检查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓内的脂肪，结内的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜线附近的脂肪用刀切除，这样就不需要切开整个淋巴结被膜。有人会说，我把一些组织去掉后，可能导致漏判一些阳性的淋巴结，但我的经验是好的干净的片子比含有太多脂肪的差片子更容易获得阳性的结果。当你在休整组织或切片的过程中脂肪组织意外出现时，你也可以使用前面的挖凿技术。2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片切片时尽量避免脂肪先接触刀片，因为脂肪会脱离包埋物，在切片上留下一个洞，如果不能避免，也要在其周围加上包埋物，让包埋物先接触刀片。3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度切片机的台面和刀片必须保持干净，假如你弄碎了一张片子必须即时用一块干纱布清理干净，但要防止刀片割手，如果你发现切出来的片子有条纹或者堆积成束，可能是组织粘着在刀片的下方了，必须除掉刀片上的组织，并将刀片清理干净。组织块越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪组织就变得坚硬难切，同时水性的组织会裂开，这就有必要在切片温度的最冷端和最温端取一个二者兼顾的中间值，以使脂肪和非脂肪组织都能切好。我一般将组织块冻在-24度，可以获得满意的结果，冷冻喷雾剂有用，但要注意先清掉切片机内的污秽。。冰冻切片的基本技术1.从锋利的刀片开始我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。2.坐着还是站着我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。3.刷子4.握持刷子左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。5.摇柄的旋转以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。。7.贴片可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一个角度粘住片子的一角，在静电作用下片子会吸附在玻片上并迅速融化。当然在周围涂一些包埋物对贴片有利，这种多余的包埋物可以保护片子的边缘免受皱缩的损坏。有时候碰到贴片困难，我会在切到最后2mm包埋物的时候停下来，让片子留在组织块上，然后倒转摇柄，使组织块退离刀片，再用刷子从边缘把组织片摊平，这样就可以从组织块面贴片了，这对卷曲的片子或者脂肪组织非常管用。8.快速固定我右手转动摇柄也同时拿着玻片，片子一切好，立刻粘起片子并将它浸没于。需置于方便够到的地方，我一般将染色架放在染色缸的旁边，先将片子置于，然后插于染色架上。如果组织固定延迟会出现风干的假象，我的经验是组织片还在切片机的台面时，风干效应很小，当组织片粘在有温度的玻片上时就会出现明显的风干假象，表现为核的细节丢失及胞浆液的溢出。下面几张图片是延迟15秒固定和立刻固定的相同组织的比较，差异非常明显9.切片的厚度

冰冻切片的局限1.时间的限制2.特殊染色的局限这个问题讨论起来很难，我们只能面对，当今时代如果没有免疫过氧化物酶染色和基因突变的检测，仍然无法对淋巴瘤和肉瘤及其他类似的疾病进行分类，也许不久的将来能有快捷的方法用于冰冻切片，但是现在，确实是一个缺陷。3.冰冻假象这是水的特性，水在结冰时因氢键的交联而膨胀，正是这个原因，冰块才能浮在水面上。我相信组织在冰冻时候的变化与水结冰膨胀是密切相关的，在此，我会尽量解释冰冻片子和石蜡片子的差异。象处理其他病理假象一样，正确的识别这些冰冻假象有助于我们不至于误判。4.冰晶的形成含水量特别多的组织冷冻时会出现肥皂泡样的空隙，我认为当组织中的水分凝固时形成球形的冰晶，挤压纤维组织条而产生泡沫样的形状。下面的冰冻对照显示当组织片进一步处理时泡沫样的水分又重新分布于间质，而未曾冷冻的组织显示出间质的水肿。这些水分巨多的组织在切片时很难保证不裂开，应尽可能高切片的温度5.挤压假象细胞实性的组织会受到冰泡膨胀的挤压，这在水肿组织非常明显，下面的肾细胞癌提供了一个很好的例子，中间的图片显示肾小管被透明的冰晶所挤压，右边的图片为来源于同一组织的非冷冻切片。

浅谈怎么切好冰冻切片（转载自丁香园）