实验一、大肠杆菌质粒DNA提取

一、原理

采用碱变性法抽提质粒DNA用于载体构建、基因分离、目的片段亚克隆、重组体鉴定等分子操作。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离当以pH 5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时.变性的质粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、材料

1、 菌种：E.coli JM109

2、 pUC18质粒(如图)。

3、 LB培养基

蛋白胨 10g

酵母浸出粉 5g

氯化钠 10 g

用950ml蒸馏水溶解用10mol/L NaOH调pH至7.0定容至1000ml分装1×105高压灭菌。

三、试剂

(1)、溶液I ：50mmol/L葡萄糖25mEnol/L Tris·Cl（pH8.0）10mmol/L EDTA(pH8.0)6.90×104pa消毒15分钟4℃贮存。

(2)、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS。

(3)、溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60ml冰乙酸11.5ml　dH20　28.5m1。配制好的溶液Ⅲ中钾盐浓度为3mol/L、乙酸根浓度为5mol/L。

（4）、50mg/ml氨苄青霉素：取50mg氨苄青霉素，溶于1ml灭菌蒸馏水，过滤除菌。-20℃保存。

(5)、10mg/ml RNA酶(无DNA酶)：称取loomg RNA酶粉剂溶于10ml　10mmol/L　Tris·Cl(pH7.5)　15mmol/L NaCI缓冲液中水浴煮沸15分钟　缓慢冷至室温。分装-20℃贮存备用。

(6)、碱酚：纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体,使用之前必须重蒸, 除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解,重新进行蒸馏,当温度升至183℃时,开始收集在若干个棕色瓶中,纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃。使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等体积的lmol/LTris--HCl(pH8.0)缓冲液,立即加盖,激烈振荡,并加入固体Tris摇匀调pH(一般looml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6-8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中,并加一定体积0.lmol/LTris-HCl pH8.0)覆盖在酚相上,置4C冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂,能引起腐蚀性损伤,操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚,应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红,要随时加盖,也可加入抗氧化剂0.1% 8一羟基喹啉及0.2%β-巯基乙醇。

7、TE（pH 8.0）

Tris-HCl 10mmol/L(pH 8.0)

EDTA 1mmol/L(pH8.0)

四、仪器

1、 低温高速冷冻离心机

2、 控温摇床

3、 振荡器

4、 紫外分光光度计

五、方法

1、从LB平板上挑取单菌落接种于2ml含60µg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基（加入2µl 50mg/ml的氨苄青霉素）中，37℃条件下250r/min振荡培养过夜(至对数生长后期)。

2、取1.2~1.5ml菌液移至1.5ml无菌离心管管中，4℃ 12000g离心30秒,弃去上清液,尽量去残液。

3、向离心管内加入100μl冰预冷的溶液I涡旋振荡悬浮菌体。

4、加入200μl新配制的溶液Ⅱ，迅速盖严离心管盖，快速颠倒〈千万不要振荡〉离心管5次，将离心管放置冰上。

5、中加入150μl溶液Ⅲ ，盖紧管口，颠倒离心管10次，置冰上3~5分钟。

6、4℃ 12000g离心5分钟，将上清液转入1.5ml无菌离心管。

7、加等量的酚：氯仿（1：1），振荡混匀，4℃ 12000g离心2分钟，将上清转到另一离心管中。

8、加等体积的氯仿抽提1次，4℃ 12000g离心2分钟，将上清转到另一离心管中。.

9、加入2倍体积无水乙醇，振荡混合，于室温下放置2分钟。

10、加入1ml 70%乙醇，放置2分钟后，4℃ 12000g离心2分钟，去上清。

11、重复第9步，尽量去残液，在空气中干燥DNA。

12、用50μl TE溶解质粒DNA，加入1μl 10mg/ml的无DNA酶的RNA酶，室温放置30分钟。

13、电泳检测纯度紫外吸收法测定含量。

六、说明

1、质粒DNA提取的方法很多本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。

2、核酸在pH大于5小于9的溶液中稳定，但当pH大于12或小于3时就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。当加入NaOH使其pH大于12因而使染色体DNA与质粒DNA变性。SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(l )溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合为蛋白质的复合物使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中必须把它去干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受干扰。

3、3.0mol/L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性使变性的质粒DNA能够复性并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不仔在超螺旋共价闭合环结构)。而高盐的3mol/LNaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS一蛋白质复合物凝聚而沉淀。pH5.2也能中和核酸上的电荷减少相互斥力而互相聚合。同时钠盐能与SDS一蛋白质复合物作用后 。形成溶解度较小的钠盐形式复合物使沉淀更完全。

4、碱酚：酚是一种表面变性剂属非极性分子。因为在酸性pH 条件下DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平衡使其pH值在7.8以上。水是极性分子，当蛋白质溶液与酚混合时蛋白质分子之间的水分子被酚挤走使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大因而与水相分离沉淀在水相下面 。酚比重更大保留在最下层 。酚作为变性剂，也有一些缺点：(l)、酚与水有一定程度的互溶。酚相中水的溶解可达大约10%~15%溶解在这部分水相中有DNA会损失；(2)、酚很容易氧化变成粉红色氧化的酚容易降解DNA。解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸除去氧化的部分，再用Tris-HCl缓冲液饱和使酚不至于夺去DNA中的水带走部分DNA。饱和酚中加上8一羟基喹啉及巯基乙醇防止酚氧化，同时它们还是弱的螯合剂可抑制DNase。由于有颜色溶解在酚中后，使酚带上颜色便于酚相与水相的分离。酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液隔绝空气阻止酚氧化。

5、关于无水乙醇沉淀DNA的说明：

用无水乙醇沉淀DNA-是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性可以以任意比例和水相混溶乙醇与核酸不会起化学反应对DNA很安全因此是理想的沉淀剂。乙醇之所以能沉淀DNA是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA当加入乙醇乙醇会夺去DNA周围的水分子使DNA失水而易于聚合沉淀。一般实验中用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合 。使乙醇的最终含量占67%左右。由此可预见也可用95%乙醇沉淀DNA-但是用95%乙醇使总体积增大而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因而DNA损失也增大影响收率。乙醇沉淀DNA溶液时DNA溶液中应该有一定的盐浓度中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低要加NaAC或NaCl至最终浓度1~0.25mol/L。在pH 8左右的DNA溶液中DNA分子带负电荷加一定浓度的NaAC或NaCl使Na+中相DNA分子上的负电荷减少DNA分子之间的同性电荷相斥力易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合这样就造成DNA沉淀不完全。但当加入的盐溶液浓度太高时其效果也不好在沉淀的DNA中由于过多的盐杂质存在影响DNA的酶切等反应必须进行洗涤或重沉淀。乙醇沉淀DNA一般采用低温条件这是由于在低温条件下 。分子运动大大减少DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀一般保存时间总是过长的同时也要视样品的体积而异在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少冷却就较迅速。大量提取DNA时通常采用冷冻过夜。

实验二、总DNA提取

一、原理

总DNA的分离通常是在有EDTA及SDS、CTAB一类的去污剂消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这里介绍的方法是CTAB法。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中可溶并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3mol/L NaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀下来，而大部分及多糖仍溶于溶液中。通过离心将CTAB-核酸沉淀下来。本方法分离的DNA, 主要用于DNA杂交、PCR扩增、RFLP及RAPD分析以及基因组克隆分离纯化目的基因。

二、材料

水稻叶片。

三、试剂

1、2×CTAB抽提缓冲液：

CTAB 2%

Tris-HCl(pH8.0) 100mmol/L

EDTA 20mmol/L

NaC1 1.4mmol/L

巯基乙醇 2%

2、10%CTAB溶液

NaC1 0.7mmol/L

CTAB 10%

3、沉淀缓冲液

CTAB 1%

Tris-HCl(pH 8.0) 50mmol/L

EDTA 10mmol/L

巯基乙醇 1%

4、 盐TE

Tris-HCl(pH8.0) 10mmol/L

EDTA 1mmol/L

NaC1 1.0mol/L

5、碱酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6、TE（pH 8.0）

Tris-HCl 10mmol/L(pH 8.0)

EDTA 1mmol/L(pH8.0)

7、10mg/ml RNA酶(无DNA酶)：称取loomg RNA酶粉剂溶于10ml　10mmol/L　Tris·Cl(pH7.5)　15mmol/L NaCI缓冲液中水浴煮沸15分钟　缓慢冷至室温。分装-20℃贮存备用。

四、仪器

1、低温高速冷冻离心机

2、振荡器

3、紫外分光光度计

五、方法

1、取1~2g新鲜幼嫩叶片去除叶脉于液氮中迅速研磨成粉。

2、将冻粉迅速转入提取缓冲液中，加入1体积约0.5ml 2×CTAB抽提缓冲液，混匀，于65℃保温30min。其间轻柔搅动2~3次。

3、取出离心管冷至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇轻轻颠倒混匀，静置10min。

4、4℃ 12000g离心5min，取上清至一新管中。

5、加入1体积的10%CTAB溶液和1体积的氯仿/异戊醇轻缓颠倒混匀，4℃ 12000g离心5min。

6、去上清，加入0.5ml高盐TE溶解沉淀，4℃ 12000g离心5min。

7、取上清，加入2体积的冷无水乙醇，4℃ 12000g离心5min，去上清，沉淀用1ml 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下干燥，溶于500μ1TE缓冲液（pH8.0）。

8、加入终浓度50µg/ml的RNA酶（2.5µl 100mg/ml RNA酶）室温下放置半小时，-20℃冰箱中放置。

六、说明

1、 总DNA的提取方法通常有SDS法和CTAB法，SDS是一种离子型去污剂，而CTAB是一种非离子型去污剂。对于新鲜的材料，两种方法均能提取较高质量的DNA。

本人在实验中发现，对于含糖和酚类物质较多的材料，如一些较老的植物材料和一些真菌材料，在用SDS提取的过程中，经常会发现所提取的DNA呈黄色，不易进行酶解。以前有人也发现过类似的问题，并建议增加还原剂如巯基乙醇或维生素的含量加以解决。但这种改进的方法不能从根本上解决问题。而用CTAB法能较好解决上述问题。因此本人偏爱此法。

实验三、 总RNA提取

一、原理

总RNA的提取方法有多种，其中异硫氰酸胍法苯酚法较常用。异硫氰酸胍法是国外实验室所常用的一种方法，但成本较高。苯酚法成本较低，国内有些实验室采用本方法提取RNA，国外较少用此法。本实验利用利用异硫氰酸胍法提取总ＲＮＡ。异氰酸胍是一种强烈的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质而导细胞结构破坏，核蛋白由于二级结构的破坏而从核酸上解离下来。ＲＮＡ酶耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，但却被４mol/L异硫氰胍和β－巯基乙醇等还原剂所灭活。因此可联用上述试剂，可从组织中提取完整无缺的ＲＮＡ。所提取的RNA可用于RNA杂交、mRNA纯化、RT-PCR及DDRT-PCR等。

二、材料

植物幼嫩组织器官或种子萌发的幼苗。

三、试剂

1、异硫氰酸胍溶液：4mol/L异硫氰酸酸胍，25mmol/L柠檬酸钠（pH7.0），0.5%十二烷基氨基氨酸钠，0.1mol/Lβ－巯基乙醇。

2、2mol/L NaAC(pH4.0)：用经DEPC处理过的水配制高压灭菌。

3、水饱和苯酚(pH3.5)：取融化的酚，加入灭菌的重蒸水，混匀后静置，酚在溶液的下层。

四、仪器

1、低温高速冷冻离心机

2、振荡器

3、紫外分光光度计

五、方法

１、取两只50ml离心管各加入15ml异硫氰酸胍溶液于冰上预冷。

２、取5g新鲜的幼嫩植物组织放在研钵中加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。

３、将粉末全部移入冰上预冷的离心管中振荡离心管混合均匀将离心管置冰上。

４、加入2mol/L NaAC 1.5ml、水饱和酚15ml和氯仿/异戊醇3ml，每加一种试剂都轻轻摇晃离心管，混合均匀，最后将离心管盖紧倒转几次混合均匀，冰浴15min。

５、4℃　12000g离心10 分钟，将上层水相转移到另一干净的离心管中，向管中加入等体积的异丙醇混匀置-20℃冰箱冷冻1h。

６、4℃条件下12000g离心10min，小心去除上清液，沉淀溶于5ml异硫氰酸胍溶液中(体积为第一次异硫氰酸胍溶液体积的1/3)，再加入等体积的异丙醇混匀后置-20℃冰箱冷冻1h。

７、4℃条件下12000g离心10min，沉淀用70%乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于适量体积(约500μl～1000μl)DEPC处理的水中。

8、用微量核酸测定仪检测后，分装于-70℃低温下保存。

六、说明

1、RNA酶极不易灭活，在提取RNA的过程中，普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须经过处理。灭菌的一次性使用的塑料制品基本无RNA酶污染，可以不经过预处理而直接制备和贮存RNA。实验室的普通器皿和塑料制品使用前必须于180℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）可用氯仿冲洗（塑料制品）。另上较常用的方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡用于制备RNA容器。灌满DEPC的容器于37℃保温2h以上，然后高压灭菌，枪头也需高压灭菌。

2、在RNA提取的过程中所用的酚必须是酸酚。在酸性pH条件下DNA分配于有机相，而RNA则分配于水相中，这样使DNA和RNA分开。重蒸酚是酸性，加入灭菌的重蒸水即为酸酚。

附：苯酚法

一、试剂

1、研磨缓冲液：6% 4-氨基水杨酸盐，1%三异丙基萘硫酸盐，6%苯酚，50mol/LTris-Cl (pH8.4)。

2、4mol/L NaAc（pH6.0）

二、方法

1、 研钵及杵用液氮预冷。

2、 取新鲜幼嫩的植物材料1～5g，剪成小块，取出冷冻材料置研钵中加入液氮研至细粉状。

3、加入研磨缓冲液(1g材料加2ml)转入50ml离心管中。

4、加入约一倍体积的苯盼/氯仿/异戊醇，混匀，于冰上融化。融化后4℃，12000g离心10min。

(5)上清液转至新离心管中重复用苯酚/氯仿/异戊醇抽提3次。

(6)将上清液转入新离心管加入4mol/L NaAc(pH6.0)至终浓度为0.2mol/L，混匀然后加入2.5倍体积的冷的乙醇混匀，4℃条件下12000g离心10min。小心去上清液沉淀溶于较小体积的灭菌重蒸馏水中。

(7)加入4mol/L NaAc(pH6.0)至3.0mol/L，混匀置冰上2~3h。然后4℃条件下12000g离心10min。去上清，沉淀溶于200~1000μl 0.2mol/L的NaAC中，加入2.5倍体积冷乙醇，4℃、12000g离心10min。

(8)用70%乙醇洗沉淀两次，真空干燥，溶于100μl～500μl DEPC处理的灭菌水中。贮于-70℃。

实验四、总RNA中mRNA的分离

一、原理

生物的绝大多数的mRNA在其3’端均有一个poly(A)尾因此可用Oligo(dT)-纤维素亲和层析法从细胞总RNA中分离出mRNA。分离纯化mRNA用于RT-PCR、cDNA合成及构建cDNA文库、RNA杂交及基因表达调控研究等。

二、材料

水稻叶片的总RNA。

三、试剂

1、上样缓冲液(1×)：20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/LEDTA，0.1%十二烷基氨酸钠，高压灭菌室温贮存。

(2)洗脱缓冲液：10mmo1/L Tris·Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA（pH8.0），0.05%SDS高压灭菌室温贮存。

(3)oligo(dT)纤维素。

(4)4mol/L NaAC(pH8.0)。

(5)DEPC处理的水。

四、仪器

1、低温高速冷冻离心机

2、紫外分光光度计

五、方法

1、制备层析柱

1）、取一支硅化灭菌的巴斯德管，用洗净灭菌的玻璃棉塞上出口。

2)、取约5~15mg的oligo (dT)纤维素悬浮于2ml上样缓冲液(1×)中，待oligo(dT)沉下去后，小心移去上清液，再用上样缓冲液(1×)悬浮，重复几次，至上清液完全清澈，备用。

3)、吸取oligo(dT)纤维素悬浮液装柱，注意柱中液体不能流干，不要有气泡。用10ml上样缓冲液(1×)洗柱。

2、层析分离mRNA

1)、取一定体积的总RNA提取液，加入等体积的上样缓冲液(2×)，于65℃加热7min，然后冰浴5~10min。

2)、待洗柱的上样缓冲液都过柱后，立刻将RNA样品上柱（总体积以2ml）为佳，收集流出液，然后重新上柱，重复5~6次。

3)、用10~l00ml的上样缓冲液(1×)洗柱除去rRNA、tRNA。

4)、将洗脱缓冲液置45℃水浴预热，待第3步洗柱液流出后，加预热的200μl洗脱缓冲液，洗脱重复5次，收集洗脱液。

5)、在分光光度计上测定各管洗脱液的RNA浓度（1.0A260=37μg/ml mRNA）。

6)、向各管洗脱液中加入4mol/L NaAC (pH 6.0)至终浓度为0.2mol/L，混匀，然后加入2.5倍体积的无水乙醇置-70℃放置1小时以上。

7)、使用时将管取出12000g，离心15min，真空干燥沉淀，再溶于适量的DEPC处理的水中。

六、说明

1、石英比色杯要浸泡在浓盐酸中使用时用DEPC处理的水彻底冲洗干净。

2、如果没有洗脱出mRNA产生的原因可能有：1)RNA样品与oligo (dT)纤维素混合不充分；2）洗脱不彻底。最好将洗脱液收集起来以便进行再处理上柱。

3、在分离mRNA的甲醛变性胶上仍然能够隐隐约约地见到28s和18s rRNA的条带这是因为rRNA太多不容易全部除去的缘故。

4、柱床体积为1ml的oligo (dT)纤维素最大载样量为10mg总RNA，如果RNA的量较少，则应减少oligo (dT)纤维素的使用量，以防mRNA在过柱以及后续步骤中损失。

5、美国Promega公司生产一种利用磁珠来分离mRNA的试剂盒，一个试剂盒约1000元，可做三次提取，分离效果好，且分离时间短，其成本与oligo (dT)纤维素不相上下。

实验五、cDNA合成

一、原理

合成cDNA第一链的方法用反转录酶来催化的。用12-18个核苷酸长度的oligo（dT）作引物，与mRNA的Poly(A)尾退火，在反转录酶的作用下后成cDNA的第一链。合成的mRNA与cDNA的杂交体在RNaseH 的作用下不完全降解mRNA，产生一系列RNA引物，它们被DNA聚合酶Ⅰ用以合成第二链。合成cDNA供目的基因扩增和建立cDNA文库筛选目的基因。第一链的合成见分子克隆图8.3。

第二链的合成见图8.5。

二、材料

水稻叶片中所提取的mRNA。

三、试剂

1、10×第一链合成缓冲液：1.0mol/L Tris·Cl(pH 8.3)，100mmol/L MgCl2，1.4mol/L KCl，2mmol/L明胶。

2、10×第二链合成缓冲液：1.0mol/L Hepes，100mmol/L MgCl2，0.7mol/L KCl。

3、100mmol/L DTT。

4、10mmol/L dNTP(每种)。

5、RNasin。

6、2.5U/μl AMV反转录酶。

7、1mmol/L NAD。

8、10U/μlDNA聚合酶Ⅰ

9、1U/μl E. coil DNA连接酶

10、1.9U/μl RnaseH.

11、250mmol/L EDTA.

12、0.5μg/μl oligo(dT).

四、仪器

1、低温高速冷冻离心机

2、紫外分光光度计

五、方法

1、第一链合成

(1)、取1~5µg mRNA提取物溶于20μl DEPC处理的水中。

(2)、加入2μl oligo (dT)混匀65℃水浴热变性5~10min，缓慢降至室温。

（3）、按顺序加入以下试剂：1μl RNasin、5μl 第一链缓冲液、5μl DTT、5μl dNTP、2μl AMV反转录酶加dH20至50μl 。

（4）、混匀置42℃水浴保温1h。

2、第二链合成

(1)、按顺序加入如下试剂：45μl第一链反应液、23μl 第二链缓冲液、23μl DTT、7μl NAD、2.5μl DNA聚合酶I、 1μl E .coli DNA连接酶，加dH20至230μl 。

(2)、混匀置16℃水浴中保温30min。

(3)、加入11μl RnaseH，混匀16℃继续保温2h。

(4)、此反应液可直接用于连接反应，必要时用氯仿抽提乙醇沉淀出cDNA。

六、说明

(1)第一链合成后即可进行PCR扩增(称RT-PCR)获得某目的基因。

(2)第二链合成后可用于连接。

实验六、核酸定量分析

一、原理

在DNA分子操作过程中, 常需要检测DNA及RNA的纯度及浓度为分子操作及基因转化提供依据。例如要对DNA进行酶切、PCR、测序等操作都需要对DNA进行定量。常用DNA定量方法有两个,一个是紫外光谱分析法,另一个是EB荧光分析。EB荧光分析：EB也就是溴化乙锭,是一种荧光染料,它能插人DNA或时认的碱基对平面之间而结合于其上。一旦EB结合在DNA分子上,它就能在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和!数量成正比,因此荧光强度可以表示DNA量的多少。这种方法的优点是简单,经济,若结合凝胶电泳还同时分析出DNA的纯度。缺点是准确性较低。

本实验主要介绍紫外光谱分析法，其原理基于DNA(或RNA)分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状双链、单链之间的转换,也会导致吸收水平的改变,但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是：准确,简便,但需要紫外分光光度计。

二、材料

DNA或RNA提取物。

三、试剂

DNA或RNA分子质量标准物。

四、仪器

1、紫外分光度计

五、方法

1、预热紫外分光光度计10～20分钟。

2、取两只1ml的狭缝石英比色杯，一只装入1ml dH20溶液作为空白溶液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。

3、取5μl DNA待测样品或4μl RNA样品加入另一只比色杯中，加dH20至1000µl，用比色杯盖或无菌石蜡膜堵柱杯口倒转混匀。

4、将两只比色杯置分光光度计中，调入射光波长分别用空白溶液调整零点(T为100，OD为0)测定待测样品液在260nm、280nm、230nm的OD值。

5、计算浓度：

双链DNA OD260=1.0时，溶液浓度为50µg/ml。

双链DNA样品浓度(µg/µl)=50×（OD260－OD280）×N(样品稀释倍数)。

单链DNA OD260=1.0时，溶液浓度为33µg/ml

单链DNA样品浓度(µg/µl)=33×（OD260－OD280）×N(样品稀释倍数)。

单链RNA OD260=1.0时，溶液浓度为40µg/ml

单链RNA样品浓度(µg/µl)=40×（OD260－OD280）×N(样品稀释倍数)。

六、说明

1、 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。小于1.6时，表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质如核苷酸、氨基酸、酚等。

2、 纯的RNA溶液其OD260/OD280的比值应介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值应大于2.0。RNA样品OD260/OD280的比值小于1.7，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。

实验七、目的基因的PCR扩增

一、原理

PCR的原理与体内DNA复制的过程相似,是由三个基本反应组成的循环性过程。1、变性：将所要扩增的双链DNA加热，解链成单链DNA；2、退火：使温度下降,寡聚核苷酸引物与所要扩增基因两侧DNA按碱基配对原则结合；3、延伸：在适当的缓冲液中,Mg2+及4种dNTP存在下,DNA聚合酶能忠实地按模板的碱基顺序合成互补链,即从引物的3’-OH延伸,方向为5’一3'。可合成二分子与模板顺序完全相同的DNA。变性、退火、延伸三步反应反复循环,每循环一次所生产的DKA均能成为下一次循环的模板。因此20次PCR循环将产生约一百万倍的扩增产物。

二、材料

水稻基因组DNA；

引物为5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’和5’-A（A/G）IGCTA（A/G）IGGIA（A/G）ICC-3’。

三、试剂

1、10×buffer 1/10体积

2、10×dNTP(各2.5mmol/L)

3、Taq酶

四、仪器

1、PCR仪

2、电泳仪

五、方法

1、在1.5ml离心管 PCR薄壁管中建立25µl(体积)的如下反应体系：

dH2O 20.0µl

10×buffer 2.5µl

10×dNTP(各2.5mmol/L) 2.5µl

引物1(20pmol/µl) 1.0µl

引物2(20pmol/µl) 1.0µl

模板DNA(200ng/µl) 2.0µl

Taq酶1U (1U/µl) 1.0µl

25.0µl

2、轻轻混匀，瞬时离心，置PCR扩增仪中，盖上加热帽(使用无加热帽的PCR仪时反应混合液上应覆盖50µl的石蜡油)。

3、反应程序

95℃变性2~5mins后，进入94℃变性30~60s，50℃~70℃退火30~60s，72℃延伸1~2min，30~40个循环后于72℃延伸10mins。

4、扩增产物的检测：取5~10µl 的反应混合液，进行1.0%~1.2%的琼脂糖凝胶电泳，胶上要有分子质量标准DNA样品作参照。

5、将所扩增条带从胶上切下回收DNA纯化供连接转化用（步骤如下面的实验）。

六、说明

1、影响PCR的因素

（1）、耐热DNA聚合酶

耐热DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermusqauaticum,Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶。Taq酶是从水生栖热菌株YT中分离的DNA聚合酶,该菌能在70～75℃的环境中生长,1969年从美国黄石国家公园的一个温泉中分离出了这个菌株。

由于采用了耐热DNA聚合酶,才改变了PCR的命运,使PCR广泛应用成为可能。一开始PCR所用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段,由于该酶不耐热,在一个循环中,变性之后都要加酶。20次循环要加20次酶,这样PCR反应成本很高,一般实验室无法开展工作。每次都加酶,也使反应复杂。

自1987年后Taq DNA聚合酶被纯化和使用后,PCR技术就在分子生物学的各个领域等于到了非常广泛的应用。从这个意义上讲,是Taq DNA聚合酶给PCR技术注入了新生命力。当然,PCR技术也促进了Taq DNA聚合酶的研究,使Taq DNA聚合酶的基因很快被克隆并在大肠杆菌中表达,酶的产率得到了很大提高,使该酶成本大大降低。

Taq酶最适温度75～80℃，对Mg2+敏感, Mg2+浓度适中直激活作用,浓度太高抑制酶活性。没有3'→5'酸外切酶活性，有依赖于DNA合成作用的链置换的5’→3'核酸外切酶活性。适当浓度(50mmol/L KCl激活50～60%,高于此浓度抑制活性。每80,000碱基对中错一个碱基，25轮循环之后,400个碱基对中错一个。dNTP与Mg2+增高,错误率加大。反应总体积为100μl时,酶用量为1～2.5U然而,由于DNA的不同和引物不同,以及其他条件的差别，Taq酶用量亦有差异。Taq酶的试验用在0.5～5U之间。根据电泳结果决定酶的最佳用量。若酶的用量偏高,有非特异性产物出现。若酶的用量偏低,则合成产物量少。

（2）模板量为105～106目的分子。人基因组DNA单拷贝基因约含3×106目的分子；l0ng酵母细胞约含3×105目的分子；lng大肠杆菌细胞约含3×105目的分子。

（3）模板量与循环次数的关系

目的分子数 循环次数

3×105 25～30

1.5×104 30～35

1×103 35～40

50 45～50

若模板来源、困难,以合适模板量及最小循环数为宜。

2、引物的条件

（1）、长度

引物的长度为15～30个核苷酸(NT)之间，常用20NT左右。近年来,由于引物合成成本的降低,为了增加特异性,引物长度有增加的趋势。

（2）、跨度

常扩增2Kb以下的片段,但长片段扩增试剂盒也可扩增l0kb以上,有的达数10kb。

（3）、顺序要求特异的顺序。可通过基因数据库检测与相关基因的同源性。

（4）、碱基

GC为40～60%,GC太少扩增效果不佳,GC过多易出现非特异性条带,ATGC最好随机分配,避免成串的瞟呤和嘧啶,任一碱基的百分含量都在10%～40%之间,不出现5个以上同一核昔苷的寡聚体。

（5）、Tm值

PCR引物的Tm值应为55～80℃。

对于PCR引物,Tm值计算一般以每个G或C4℃,每个A或T 2℃计算,即：Tm=4×(G+C)十2×(A十T)。

（6）、二级结构

避免引物内部出现明显的二级结构,如：5’-G G C C T T A T A T T G G C T A A G G C C-3’。其内部可形成明显的二级结构。

5'-G G C C T T A

3'-C C G G A A T

（7）、引物间互补

一对引物的顺序不应互补,尤其是避免了端的互补,以免形成引物二聚体。如：

5’A A G G C C T T C G A-3’

3’G C T A G C T A G C T T C A G-5’

（8）、引物二端

3’端：3'端的碱基要求严格配对,特别是最末及倒数第二个碱基要求绝对配对。如果不知待扩增序列,而是从氨基酸推测DNA的顺序,引物的3’端最好选择只有一个密码子的甲硫氨酸或色氨酸,如果3'端最末的碱基不肯定,可用次黄嘌呤取代,因为次黄嘌呤(I)可与ATCG配对,这样可避免因3’末端碱基不配对而造成PCR失败。5’端：引物5'端要求不严格,5’可附加一段与模板非互补的序列,可长至45NT,而不影响扩增。这可衍生出加端PCR。

（9）、cDNA引物

除了上述条件外，还应注意二个引物应跨越一个或二个内含子,或选择二个外显子剪接处的顺序,这样可以避免基因组DNA的污染而影响结果。引物退火时就不与基因组DNA结合,而只与cDNA结合。

(10) 、引物量

每条引物的浓度为0.1~lμmol或l00pmol~1000pmol转换成μg必须乘以分子量。如0.lμmol引物转变为μg则为0.l×引物分子量。引物的精确分子量可用下列公式计算。引物分子量=An×312.2+Gn×328.2十Cn×288.2+Tn×303.2－61。式中,An、Gn、Cn和Tn分别为A、G、C和T的数量。合成引物时,含量单位常用A260或OD260表示。lA260单位指溶于lml pH7.0磷酸缓冲液，在1.0cm光路中测定260nm的光密度值为1.0的冻干寡聚核苷酸量,lA260单位单链DNA=33μg。引物可直接溶于水或pH7.0（或接近pH7.0）的缓冲液保存冻干粉-20℃数年；溶液-20℃数月。

实验八、琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA

一、原理

用于DNA分离、纯化和鉴定的凝胶电泳有二类,一类是琼脂糖凝胶电泳,适用于lkb和大于lkb以上DNA;另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳,适用小于lKb的DNA。琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便,快速分离、纯化和鉴定DNA的方法,已广泛应用于核酸研究中。DNA在琼脂糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、DNA分子大小、DNA分子的构象及电泳电压密切相关。染色采用澳化乙链(EB),EB在紫外线照射下的发射荧光。EB能插入DNA分子中形成荧光结合物,使发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量。将已知浓度的标准样品作电泳对照,就可估计出待测样品的浓度。

二、材料

质粒DNA、水稻基因组DNA和PCR扩增产物。

三、试剂

1、电泳缓冲液：50×TAE：称取242g Tris 溶于600ml的蒸馏水中，加入57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)蒸馏水定容至1L。电泳时使用1×TAE。

2、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取186.1g EDTA-Na2·2H2O,加入800ml蒸馏水磁力搅拌器上搅拌，加入NaOH调pH至8.0定容至1L。

3、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液）：称取溴酚蓝250mg，加蒸馏水80ml，溶解后，再称取蔗糖40g，加入溴酚蓝溶液中，溶解后，加蒸馏水定容至100ml。贮存于4℃。

4、EB（10mg/ml溴化乙锭）：称取1g 溴化乙锭溶于100ml 蒸馏水中。

5、λ/HindⅢ

四、仪器

1、 电泳仪

2、 微波炉

3、 紫外检测仪

4、 电泳槽

五、方法

1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.15g，溶解在15ml电泳缓冲液（1×TAE）中，置于微波炉中至琼脂糖溶化均匀。

2、灌胶：将电泳槽两侧用透明胶或医用胶布封好，然后在凝胶中加入EB 3μl摇匀。插好点样梳，将冷却到60℃溶化好的胶轻轻倒入胶板中。

3、待胶凝固后，轻轻取出点样梳，将胶布撕下。

4、在电泳槽中加入电泳缓冲液，将胶板轻轻放入电泳槽中。

5、点样：取质粒DNA、水稻基因组DNA和PCR扩增 各5µl，加入1µl溴酚蓝指示剂混匀点样。取出2µl λ/HindⅢ加入1µl溴酚蓝指示剂混匀点样。记下点样次序和点样量。

6、电泳：接上电极线，点样侧接电泳仪的负极，50V电泳溴酚蓝到达胶的边缘。

7、将电泳槽胶板拿到暗室在紫外灯下观察结果。

六、说明

1、DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳速率与凝胶的浓度、DNA分子大小、DNA分子构象及电泳电压有关。

（1）、凝胶浓度

根据待分离DNA的大小，选择凝胶中琼脂糖的含量（凝胶浓度）

(2)、DNA分子大小 线状比链DNA分子在一定浓度凝胶上电泳的迁移率与线性双链DNA分子的分子量对数成反比。

（3）、DNA分子的构象 线状双链分子在一定浓度琼脂糖中的泳动距离与DNA的分子量对数成反比。但当DNA分子牌不同的构象时，它在电声中移动的距离不仅与分子量有关，还与它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环状和超螺旋在琼脂糖凝胶中移动的速率是不一样的。高度超螺旋的DNA移动速度最快，随着超螺旋程度降低，相应DNA的移动速率依次变慢，最慢者为线状双链DNA。

（4）、电源电源 低压条件下，线状DNA在琼脂糖化酶凝胶上泳动速率和电压成正比。随着电压升高，高分子量的DNA片段泳动速率和电压不成正比关系，分辨率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电声电压不要超过V/cm。

2、DNA琼脂糖化酶凝胶电泳图谱分析离不开紫外分析灯，可是紫外光对DNA分析有切割作用。从胶上回收DNA供重组用时，避免此外光切割是非常重要的，尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯（300～360nm）可减少紫外光切割DNA。

3、溴化乙锭（EB）有毒，因此使用过程中一定要戴手套。

实验九、目的基因与载体的限制酶酶切及连接

一、原理

1.DNA的连接方法

〈1〉粘性末端连接法

将目的基因DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶或能产生相同末端的同裂酶酶切。产生相同的粘性末端,在退火条件下,末端单链间碱基配对,在DNA连接酶的作用下,共价连接封闭成新的DNA分子。

(2)同聚物末端接尾连接法

借助于末端转移酶的催化作用,在目的基因DNA的3’-OH末端加入同聚物尾Poly dC载体的3'末端加人互补的同聚物尾PolyG得用碱基配对,两片段用连接酶连接起来。

(3)平齐末端连接法

在高浓度DNA(0.2µmol/L以上),大酶量T4DNA连接酶(5u/ml)条件下,可将两种平齐末端DNA直接在体外进行重组连接。缺点是效率低,只有粘性末端连接法的1%.

(4)人工接头连接法

利用平齐连接法,将人工合成的接头(含一种以上特异的限制性酶切位点的八或十核苷酸顺序)加在外源DNA片段的两端。经特定的限制酶切割,再用粘性末端连接法,将其插入载体DNA中去。

2.DNA连接酶

在大肠杆菌和动植物细胞中都发现了DNA连接酶。DNA连接酶能催化DNA中相邻的3'-OH和5'磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。大肠杆菌连接酶和T4噬菌体感染的大肠杆菌的连接酶(T4连接酶)催化反应相似,辅助因子不同,前者为NAD,后者为ATP。DNA连接酶能封闭DNA双链中的缺口,RNA/DNA杂种双链中的单链缺口.不能封闭链RNA中的单链缺口。限制性内切酶造成的粘性末端区在结合时出现的缺口也可用DNA连接酶封闭。

3．连接反应的温度和时间跨度

连接酶反应的最适温度是37℃,但对基因操作时的连接反应不采用37℃,因为此温度下粘性末端之间氢键结合很不稳定。常用的温度及反应时间有：

12～15℃ 16小时过夜。

7～9℃ 36小时以上。

4～5℃ 1周

二、材料

1、pUC18载体DNA

2、水稻基因组DNA的限制性酶切片段（HindⅢ）

三、试剂

1、限制酶及相应的缓冲液。

2、T4DNA连接酶及缓冲液。

.

四、仪器

PCR仪

五、方法

1、水稻基因组DNA及质粒载体的酶切

(1)、在A、B两个0.5ml离心管管中分别依次加入以下试剂：

A： B：

ddH20 12μ1 ddH20 14μ1

10×buffer 2μ1 10×buffer 2μ1

水稻基因组DNA(1μg/μl) 4μ1 载体DNA (1μg/μ1 ) 2μ1

HindⅢ 1μ1 限制酶1μ1 1μ1

EcoRⅠ 1μ1 EcoRⅠ 1μ1

(2)、混匀瞬时离心。

(3)、PCR仪上37℃保温3h。

(4)、65℃保温10min灭活限制酶。

2、连接

(1)、在0.5ml 离心管管中加入以下试剂：

ddH20 15μl

水稻基因组DNA的酶切片段(0.5μg/μl ) 1μl

载体DNA (0.1μg/μl) 1μ1

10×连接酶缓冲液 2μl

T4DNA连接酶(1U/μl ) 1μl

—————————————————————————

20μl

(2)、混匀瞬时离心。

(3)、14℃连接4～16h。

(4)、-20℃保存，直接用于转化。

六、说明

1、此种连接方法是根据载体与目的片段的碱基顺序，使用两种限制酶同时消化载体及切割目的基因，这两种限制酶不产生互补的粘性未端，可防止载体及目的片段的自连，因载体及目的片段是用同种限制酶切割，产生相同的粘性末端(称为相容)，连接效率高并具有方向性，这种不对称相容末端的连接为目的基因克隆的首选。

2、酶活性通常用酶单位表示，本科单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解除1μg λDNA的酶量为一个单位。但是许多实验室制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需要适当增加酶的用量。

3、市售内切酶一般浓度很大，为节约起见，可事先用酶反应缓冲液（1X）进行稀释。酶通常保存在50%的甘油中，实验时，应将反应液中甘油控制在1/10之下。否则酶的洗性将受影响。

4、限制性内切酶的星活性

一般来说,限制性内切存在严格的识别在序列特异性,但某些条件改变,会使其对识别序列特异性的放宽,而导致在DNA内产生附加切割,限制性内切晦表现的这种活性称为星活性,或第二活性,在名称右上角加一星号表示。

产生星活性的条件

①甘油浓度

②离子强度 高盐缓冲液

③pH值7.5～8.5产生星活性

④有机溶剂DMSO（二甲亚砜）1～2%(V/V)可产生星活性。

⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+

⑥酶与DNA的比例

酶与DNA 比为(50U/μg)产生星活性。为了防止星活性的出现,所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进衍。

5、影响限制性内切酶反应的因素

限制性内切酶能否有效、特异地切割DNA,最关键的因素有(1)底物DNA的纯度与物理特性A.纯度。酶切反应要求最严的成分是底物DNA,酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反应,有些甚至改变识别序列特性,处理办法为酶切前透析或乙醇沉淀。B.DNA浓度。DNA浓度太稀加量大,含有EDTA影响结果。C.识别序列位点,及与其邻接的特异性。限制性内切酶对DNA序列显示高度特性,因此,识别序列内核苷酸的甲基化或糖苷化都会影响酶切反应,识别位点接近末端的程度也影响切割,如EcoR I要求识别序列后在末端至少有一个碱基存在才能切割。

实验十、重组质粒DNA转化大肠杆菌

一、原理

1、转化的概念

外源基因DNA片段与载体组成的重组,需先进人受体细胞,才能进行增殖与表达。以质粒为载体得到的重组体或重组子是重组质粒。把重组质粒DNA转入受体细胞(菌)称为转化。把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞(菌)叫转染。

2、感受态

感受态就是细菌吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。所以要转化成功,首先要使受体菌处于感受态。刺激细菌使之成为感受态的方法很多,如CaCl2处理、电激等。

3.DNA转化的过程

受体菌以Ca2+处理,在低温中与外来DNA分子相混合,DNA分子转化的复杂过程包括4步：

(1)吸附一完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面;

(2)转化一双链DNA分子解链,单链DNA入受体菌,另一链降解;

(3)自稳一外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环装DNA；

(4)表达一供体基因随同复制子同时复制并被转录、转译。

二、材料

1、 菌种 大肠杆菌E. coli JM109

2、 质粒pUC18与水稻基因组DNA酶切的连接产物

3、培养基

(1)、LB液体培养基

精解蛋白陈 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化纳 3g

葡萄糖 0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH20或dH20表示)溶解至300 ml。用l0mol/L NaOH调pH至7.2~7.4。分装于15ml试管中,每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅灭菌20min。

(1) LB固体培养基

取500ml三烧瓶,加入琼脂4克LB液体培养基200ml灭菌20分钟加入氨苄青霉至终浓度100μg/ml。

三、试剂

1、0.1mol/L CaCl2溶液

2、20mg/ml X-gal：溶于二甲基甲酰胺分装避光保存。

3、200mg/ml IPTG：溶于水0.22μm滤膜过滤除菌分装-20℃贮存。

四、仪器

1、恒温培养箱

2、恒温振荡器

3、离心机

五、方法

(一)、CaCl2法制备感受态细菌

1、将单菌落接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。次日按1%(v/v)的量转入新鲜50ml LB液体培养基中37℃振荡培养至OD600=0.3。

2、将50~100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，4℃下3000g离心10min去上清液。

3、离心管中各加入10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2液重悬菌体，冰浴30min。

4、4℃、3000g离心10min。

5、 去上清液，将管倒置若罔闻分钟以上，使残留的培养液流尽。

6、 将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，重悬细胞即为感受态细胞。

7、 于4℃冰箱保存一周内使用，也可立即使用。另一种做法是菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaC12溶液中，加入300μl无菌甘油或7%DMSO混匀，分装于无菌1.5ml离心管中，用液氮速冻后，置-70℃保存。使用时取出置冰中融化。

(二)、转化反应

1、用无菌吸头取200μl感受态细胞置于预冷的0.5ml离心管中，取水稻基因组DNA与pUC18连接的产物加入 60μlTE(pH 8.0)稀释4倍。取10μl稀释连接液到感受态细胞中，轻轻混匀(用手弹管壁几下)，立即置冰上30min。

2、将管放置42℃ PCR仪上热激90s。

3、立即放回冰上15min。

4、加入800μ1无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃培养45~60min。

(三)、重组质粒的抗生索及α-互补筛选

1、 制备含100μg/ml氨苄青霉素的LB的固体平板。

2、 取200μl菌液与4μl IPTG及40μl X-gal (20mg/ml)混匀。

3、 用无菌吸头将混合液移至LB平板上，再用无菌三角头玻棒将菌液均匀涂满整个平板表面。

4、 平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿于37℃培养12~16h，挑选白色菌落(含重组质粒)进行扩增并进一步进行重组子鉴定。

六、说明

1、整个过程均需无菌操作。

2、转化时要设两个对照一个是只有感受态细胞无外源DNA的负对照在筛选培养基上不能生长如有菌落则为污染或抗生素失效。另一个是感受态如胞中加入未进行连接的质粒DNA为正对照。正对照平皿中应有大量的蓝色菌落如果无蓝色菌落出现则表明感受态细胞不好。转化样品平皿中的蓝色菌落是未发生重组的质粒空载体或载体自连体的转化菌。白色菌落为重组子转化菌。

3、 转化DNA溶液与细胞混合后,一定要在冰浴条件下操作。

4、DNA连接液的盐浓度较高,与细胞混合时要加以稀释,因为高盐浓度会影响转化率。连接产物可用TE稀释4倍后按1：20比例与感受态细胞混合进行转化。

5、 源DNA的大小和结构对转化效率有很大影响,一般说来,分子越小,转化效率越高;环形分子的转化效率比线形分子的转化效率要高等于多。与共价闭环的超螺旋的质粒DNA比同种线形DNA分子的转化效率高上千倍,因此,在转化前要尽量保证重组DNA为完整的环形分子。

6、 转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高,静止生长期以后,转化能力逐渐丧失。

实验十一、 Southern印迹

一、原理

通过Southern（1975）年提出的转移技术进行基因组DNA特定序列定位。用一种或多种限制酶消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体（通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。DNA转移到固相支持体的过程中，各DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记或地高辛标记的DNA或RNA固着于滤膜 上的DNA杂交，经放射自显影或染色，可用于检测外源基因在生物体基因组中的整合的情况，鉴定转基因生物。

二、材料

1、水稻基因组DNA

2、探针来自PCR扩增回收的片段

三、试剂

1、变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

2、中和液：l mol/L Tris·Cl(pH7.4)，1.5mol/L NaCl。

3、转移液(20×SSC)：3mol/L NaCl0.3mol/L拧橡酸纳(pH7.0)。

4、 预杂交液：50%甲酰胺5×Denhardt’s5×SSPE0.1%SDS。

5、 标准杂交液：

5×SSC 50ml

1% 十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosine(W/V) 2ml

0.2% SDS 0.8ml

阻断试剂（blocking reagent） 20ml

配制方法：甲酰胺50ml50×Denthardt's 10m120×SSPE 25ml10%SDS 1ml加水至dH20总体积100m1。

6、洗膜液I ： 2×SSC，0.1%SDS。

7、洗膜液Ⅱ：0.1×SSC，0.1%SDS。

8、洗涤缓冲液（Washing buffer）：0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl,0.3%Tween 20(V/V), pH 7.5

9、1%封闭液（blocking solution）：5g 阻断试剂，用马来酸定容到500ml。

10、检测缓冲液（detection buffer）：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，50mmol/L MgCl2 (pH9.5)

四、仪器

1、DNA杂交炉

2、烘箱

五、方法

（一）、地高辛法标记探针

采用地高辛标记和检测试剂盒（DIG ＤＮＡ　Labeling and Detection Kit）以随机引物标记法标记探针。

１、取回收的ＰＣＲ扩增的质粒ＤＮＡ8μg加水定容至15μl,沸水10min，迅速置冰上。

２、加入２μl六核苷酸混合物（varc5），２μldＮＴＰ混合物（vrac6），１μl　Ｋlenow酶（vrac7），混匀，稍离心，置３７℃反应２小时。

３、加入２μl　0.2mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。

４、加入２.5μl 4mol/L LiCl，混匀，再加入75μl -20℃无水乙醇，充分混匀，置于-20℃沉淀小时。

6、 4℃，12000g离心15分钟，弃乙醇，加入100μl 70%冷乙醇洗涤沉淀，再离心2分钟，弃乙醇，晾干30分钟。

7、 溶于50μl TE中，-20℃保存。

（二）、水稻基因组DNA的酶切

1、限制酶消化：在0.5ml 1.5ml离心管管中按如下顺序及用量加入试剂建立50µl酶切体系：

无菌ddH20 　　　　17µl

10×buffer 　　　　5µl

水稻基因组DNA　　　20µl

HindⅢ限制酶　　 　2µl

用手指轻弹管壁混匀瞬时离心置37℃水浴中，酶解过夜。

2、琼脂糖凝胶电泳分离

1)、配制浓度为0.8%的琼脂糖凝胶。

2)、向酶切反应的离心管内加入5µl 溴酚蓝溶液混匀，取10μl样品点于一个样品孔中。

3)、以含有探针DNA的重组质粒作阳性对照，以不含探针DNA片段的质粒DNA为阴性对照，各取2µl加1µl溴酚蓝上样。

4)50V电压电泳到溴酚蓝至凝胶的边缘，取出凝胶置紫外灯下紫外光下检测水稻DNA样品酶解效果。

(三)、Southern印迹

1、凝胶处理

1)、将凝胶放入一大培养皿或搪瓷方盘中加入变性液(没过凝胶)浸泡45分钟，并温和不断地摇动使DNA变性。

2)、倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次。

3)、换中和液于脱色摇床上轻微摇动中和15分钟，其间更换一次中和液，浸泡15分钟。

2、印迹

1)、取一方盘方盘内加入适量的20×SSC溶液。

2)、方盘上架上一块玻璃板玻璃板，上铺一张清洁的滤纸，滤纸两端浸没在20×SSC溶液中，滤纸与玻璃板之间不得有气泡。

3)、取出中和后的凝胶倒扣(点样孔向下)于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡。

4)、剪一块与胶大小相同的硝酸纤维素膜或尼龙膜放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉。

5)、将膜转入20×SSC溶液中浸泡5min。

6)、将湿润的膜盖在凝胶上面，膜一经与凝胶接触不可再移动。

7)、将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上排除气泡。

8)、滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸(高8~10cm)，吸水纸上压0.5~1kg的重物(水平放置)转移12h。

9)、取下吸水纸及滤纸，将胶与膜一起倒扣在清洁滤纸上，用铅笔在膜上描出点样孔位置，揭去胶，胶置EB染液中浸泡20min于紫外光下检测转移效果。

10)、以2×SSC溶液于室温下浸泡滤膜5分钟。

11）、取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张滤纸上。于室温晾干30分钟以上。

12）、将晾干的滤膜放在两张滤纸中间，在烤箱中80℃烤小时。

3、预杂交和杂交

1)、将印迹膜装入盛有适量杂交液的杂交管中，68℃以低速杂交6小时。

2）、倒掉预杂交液，倒入少量的杂交液，将探针DNA溶液直接加入杂交液（20ng/ml）中，68℃低速杂交过夜。

3)、倒掉杂交液，加入洗膜液I，室温下漂洗2次，每次5min。

4)、倒掉洗膜液Ⅰ，加入洗膜液Ⅱ，于68℃洗膜2次，每次15min。

5)、倒掉洗膜液Ⅱ，加入洗涤缓冲液室温下洗膜5分钟。

6）、将尼龙膜放入1%封闭液中封闭30分钟。

7）、再用含1/5000的抗地高辛碱性磷酸酶复合物（Anti-DIG-AP）的1%封闭液封闭30分钟，然后用充足的洗涤缓冲液洗膜2次，各15分钟。

8）、将尼龙膜放入检测液中平衡3分钟，之后放入显色液中，避光显色10～40分钟，当显示出蓝紫色条带时，取出膜，用水洗5分钟，照相。

六、说明

1、 当用于检测单拷贝序列的探针为标准长度（大于500bp），并且具有高比活度时，凝胶的每一加样孔应加工10μgDNA样品；当寡核苷酸作探针时，则需30～50μgDNA。

2、 将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体的方法有3种：（1）、毛细管转移；（2）、电转移；（3）、真空转移。进行毛细管转移时，转移的速以决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的尝试小片段DNA（小于kb）在1 小时内就可从0.7%琼脂糖化酶上几乎定量地转移，而大片段的DNA转移效率较低。例如大于是kb的DNA的毛细管转移至少需要18小时，而且转移仍不完全。DNA大片段的转移前可用弱酸处理后再用强碱处理产生的DNA片段约1kb，随后可高效率地转移。

3、磷酸溴氯吲哚/硝基蓝四氮唑（BCIP/NBT）是碱性磷酸酶最常用的显色底物。，它们在酶结合部位产生深黑色的沉淀。反应速度恒定，因此可以准确控制反应程度。

实验十二、Northern印迹

一、原理

提取水稻的RNA，经变性的RNA琼脂糖电泳，分离的RNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，用放射性标记的或用地高辛标记的探针对固定在膜上的RNA进行杂交，可用于检测外源基因在生物中的表达。

二、材料

水稻的总RNA

三、试剂

1、 5×电泳缓冲液：0.1mol/L MOPS (3一(N一吗琳代)丙磺酸)(pH7.0)，40mmol/L NaAC，5mmol/L EDTA(pH8.0)。

将20.6g MOPS溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液。用2mol/L氢氧化钠溶液调pH值到7.0。加10ml经用DEPC处理的0.5mol/L EDTA（pH8.0），再加用DEPC处理的水定容到1L。高压灭菌。

3、 甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青。

4、 (4)1μg/11l RNA标准物。(5)琼脂糖。

(6)37%甲睦

四、仪器

电泳仪

五、方法

(一)、总RNA或mRNA琼脂糖凝胶电泳

1、制胶

1)、取2.0g 琼脂糖，加入ml水，4ml 5×甲醛凝胶电泳缓冲液，混匀于微波炉里加热熔化，转入55℃水浴中。

3)、于通风橱中加入2.5μl甲醛到凝胶溶液中混匀。

4)、迅速倒入制胶板中，室温下水平放置30min，待胶凝固。

2、样品准备

1)、取提纯的RNA样品4.5μl，加入2.0μl 5×甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5μl甲醛，10μl甲酰胺。

2）、于65℃温育15分钟，冰浴冷却，离心5秒，使管内所有液体集中于管底。

3）、加入2μl灭菌的并经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。

3、上样

1) 、加入1×甲醛凝胶电泳缓冲液浸没凝胶，将凝胶预电泳5分钟，电压为50V，随后将样品加至凝胶加样孔。

2)、80～100V电压电泳。电泳2小时后，混合电泳槽中的缓冲液，继续电泳。

3）、电泳后取出凝胶，将RNA标准物泳道的胶条切下，放入含0.5µg/ml EB的dH20中染色，转入无菌蒸馏水中脱色至RNA条带出现，胶旁放把尺子照相，记录标准物的迁移距离便于杂交后的条带分析。

4、印迹操作

(1)、剪和胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维素膜，于无菌水中浸湿，转入10×SSC中浸泡备用。

(2)、取一方盘，加入适量的20×SSC或10×SSC溶液，按Southern印迹操作进行使凝胶上的RNA转移到膜上(胶不需要变性、中和等过程，不能使用0.4mol/LNaOH转移，可在0.01×SSC中漂洗2~3次，以除去甲醛及EB)。

(3)、转移后将带膜的胶倒扣在滤纸上，用铅笔在膜上标出点样孔的位置，膜于80℃烘烤1~2h。此时RNA己牢固结合在膜上。

(4)、将膜放在4×SSC中漂洗置滤纸上晾干。

5、RNA杂交和显影操作均与DNA杂交和显影相同。

六、说明

1、RNA电泳分离需用变性胶。在RNA变性胶系统中，甲醛变性胶具有操作简便，分离效果好，能分离较高浓度的RNA样品等优点，并且电泳后的RNA不需经NaOH变性，可以直接转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。但甲醛有挥发性，对人体有害，制胶及电泳时要在通风橱中进行。

2、在RNA被固定在膜上之前的操作要严格防止RNA酶污染。印迹到膜上并经固定后对RNase不再敏感。

3、为节约药品杂交液，可再次使用将使用过的杂交液贮存于-20℃(一周内)，再次使用前于70℃变性15min，然后放入冷水中5min即可使用。

4、杂交过的膜如要重复使用时，可将0.1×SSC 0.1%SDS溶液煮沸，于室温下先膜2次，每次30min，膜洗后不晾干，用保鲜膜封好，于4℃保存。

植物分子生物学实验指导