第15卷第4期

1997年7月

色　　　　　谱

CH IN ESE JOU RNAL O F CHROM A TO GRA PH Y

V o l. 15 N o. 4

J u ly　1997

OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量

牟德海

(广州分析测试中心　广州　510070)

提　要　建立了邻苯二甲醛 (O PA )手动柱前衍生反相高效液相色谱法测定样品中氨基酸含量的方法。以邻苯

部得到基线分离。测定牛血清白蛋白 (BSA )的氨基酸组成和小鼠血清中的游离氨基酸,取得满意的结果。

关键词　高效液相色谱法,氨基酸分析,柱前衍生法

分类号　O 658 Q 5

B SA 30m g,用10mL 6m o l L盐酸于110℃水解24h,

取出冷却,将水解物定量转移并过滤到100mL容量

近年来,柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨

基酸的技术取得了很大的进展并有逐渐取代传统氨

基酸分析仪的趋势。因为邻苯二甲醛 (O PA )衍生步

缓冲溶液溶解,超滤,滤液备用。

[1～ 4 ]

小鼠血清,加入4倍于样品体积的无水乙醇,在旋转

生试剂,测定了牛血清白蛋白的氨基酸组成和小鼠混合器上充分混合,置4℃冰箱30m in, 15 000r m in

血清中的游离氨基酸。离心20m in,取上清液备用。

取18种氨基酸混合标准溶液或制备好的样品溶

分析,以保留时间定性,峰面积外标法定量。

3　结果和讨论

18种氨基酸混合标准溶液、B SA中氨基酸组成

和小鼠血清中游离氨基酸的 H PL C图见图1。标准

溶液连续8次进样, 18种氨基酸的保留时间和峰面积

40℃,检测波长: 340nm ,记录仪纸速2mm m in。

9%。在25～ 250nm o l L浓度范围内, 18种氨基酸峰

( 1) 18种氨基酸混合标准溶液:含每种氨基酸

999之间。以丙氨酸的文献值 (一个 B SA分子含46个

丙氨酸残基)为参比计算的 B SA的氨基酸组成见表

1,结果表明实验值与文献值基本符合。小鼠血清中

游离氨基酸的组成很复杂,除了蛋白质氨基酸外,还

4℃冰箱中保存。有很多蛋白质氨基酸的代谢产物和一些非蛋白质氨

基酸。本文根据所用标准,确定了其中的部分氨基

(1)牛血清白蛋白 (B SA )的水解:准确称取标准酸,对小鼠血清中的其它游离氨基酸未作研究。

Ξ本文收稿日期: 1996205215,修回日期: 1996208211

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色　　　　谱

15卷

图1　18种氨基酸混合标准溶液 (a)、牛血清白蛋白中的氨基酸 (b)和小鼠血清游离氨基酸 (c)的 HPLC图

F ig. 1　Chromatogram s of 18 am ino ac id synthetic m ixture (a ) , am ino ac ids in bovine

serum album in (b) and free am ino ac ids in rat plasma (c)

1. A sp , 2. Glu, 3. A sn, 4. Ser, 5. Gln, 6. Gly, 7. T h r, 8. H is, 9. A la, 10. A rg,

11. T yr, 12. V al, 13. M et, 14. T rp , 15. Phe, 16. Ile, 17. L eu, 18. L ys.

表1　牛血清白蛋白 (BSA )氨基酸组成测定结果

Table 1　Analytical results of am ino ac id composition of bovine serum album in (BSA )

每个 BSA分子中氨基酸的数目

每个 BSA分子中氨基酸的数目

氨基酸

N um ber of am ino acid in

a BSA m o lecu lar

氨基酸

N um ber of am ino acid in

a BSA m o lecu lar

Am ino acid

A sp

Glu

Ser

Gly

Thr

H is

文献

literatu re value

54

79

28

16

34

17

测定值

found

53. 8

77. 9

27. 3

15. 0

32. 8

14. 2

Am ino acid

T yr

V al

M et

Phe

Ile

L eu

文献值

literatu re value

19

36

4

27

14

61

测定值

found

18. 2

34. 7

2. 1

26. 1

13. 7

60. 5

A la 46

A rg 23 23. 0

参考文献

¨

1984; 297: 91

2　Graser T A , Godel H G, A lbers S et al. A nal B iochem ,

1985; 151 (1) : 142

L ys 59 57. 8

¨

1984; 297: 49

4　W o rthen H G, L iu H. J L iq Ch rom atog r, 1992; 15

(18) : 3323

5　Gup ta M , Amm a M K P. J L iq Ch rom atog r, 1992; 15

(12) : 215322163

4期　　　　　　　　牟德海: O PA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量　　　　　・　　・

D eterm ination of Am ino Ac ids by Precolumn D er ivatization

w ith o-Phthald ialdehyde (OPA ) and Reversed-Phase

H igh Performance L iquid Chromatography

M ou D eha i

(N ational A naly tical Center, Guang z hou , Guang z hou , 510070)

b ile p ha se (B ). A single linea r gradien t p rogram w a s em p loyed and the signa ls w ere detected a t 340nm w ith

U V detecto r. U nder the above condition s a ll 18 am ino acids in standa rd so lu tion w ere sep era ted to ba seline in

40 m inu tes. T he p recision of ana lysis w a s ob served from the rep roducib ility of the reten tion tim es and p eak

999. Ex terna l standa rdiza tion m ethod w a s u sed fo r the quan tita tion. T he m ethod w a s app lied to ana lyze

am ino acid com po sition of bovine serum a lbum in (B SA ) and the resu lts w ere in con sistence w ith litera tu re

va lues. F ree am ino acids in ra t p la sm a w ere a lso determ ined and good resu lts w ere ob ta ined.

Key words　h igh p erfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy, am ino acid ana lysis, p re2co lum n deriva tiza tion

OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量