酶催化技术在医药工业中的应用

摘要：近10年来随着生物技术的发展，酶催化技术已愈来愈多地用于有机合成，特别是不对称合成、光学活性化合物及天然产物的合成,已在医药、食品、轻工 业、纺织等行业中得到越来越广泛的应用。本文介绍了酶和细胞固定化、非水相介质中的酶催化、低共熔酶催化反应和酶催化反应与分离的祸合等酶催化技术的研究进展,以及酶催化技术在制药工业和临床诊断及治疗上的应用。

关键词：酶催化 医药工业 应用

酶作为一种高效生物催化剂,具有高度的特异立体选择性及区域选择性,并在常温、常压和pH值中性附近条件下具有十分高效的催化活力。利用酶的高效选择性催化作用可制造出种类繁多的目的产物,避免了化学法合成中的许多不足。目前,酶催化技术在医药方面的应用是当前最为关注的领域之一,这主要是因为医 药产品一般附加值高，且大多是光学活性物质，作为十分优良的手性催化剂—酶,用于多种高效手性药物的合成及制备将十分有效,潜力巨大。在生物学和化学领域中,作为绿色化学和手性技术的总要组成,酶催已经成为重点研究对象。

1、酶催化简介

酶催化可以看作在酶的表面吸附了反应物,或者是酶与反应物形成了中间化合物后进行反应。酶催化是酶的减慢或者加速化学反应作用。在多数情况下,化合物作为底物的能力的丧失,其原因是因为底物分子中微小结构产生变化所致。作为一种绿色的手性技术,酶催化工艺已经是化学制药领域重点研究的课题之一。酶催化剂催化的反应可在水中进行,其具有较高的立体选择性和区域选择性,反应条件较为温和是没催化剂催化的特点。随着人类环保意识的提高,制药工业对手性化合物需求的增加,使人们进一步认识了没催化剂。现代基因工程的应用以及生物技术的高速发展,也降低了生产酶成本。作为有机化学合成工具,没催化剂的优点在于选择性好、合成步骤少、多数能够在水相中进行、反应条件温和、催化效率高等。为了进一步提高酶催化剂的适应性和稳定性,利用生物工程改造和筛选酶催化剂。

2、酶催化技术的研究进展

随着生命学科的迅速发展和人们对生物大分子结构与功效认识的不断深人,对酶催化技术的研究及创新已取得了长足的进步。主要表现在以下几方面:

2.1 酶和细胞固定化技术

在实现酶催化生化或化学反应过程中,酶固定化技术可使酶长期反复和连续运行、大幅降低酶的应用成本、精简下游分离工艺,这已成为一个最主要和基础的 酶催化技术,现已发展了吸附、共价、交联、包埋、微胶囊、膜法等数十种固定化方法（1）,而对多酶系统的共固定化及完整细胞的固定化则是对酶固定化技术的重要发展（1）。多酶系统的共固定化比单酶固定化成本更低、稳定性更高,并可进行多酶协调催化反应,提高酶的催化效率。酶和细胞固定化技术现已获得了一批大规模工业应用的成功。Nishida等人（2）利用联合固定化棒杆菌和脱氨副球菌细胞体系,从乙酞氨基肉桂酸合成L-苯丙氨酸取得了很好的结果,其L-苯丙氨酸的产率明显高于两步分开的序列反应。胡永红等（3-7）及徐虹等（8）利用固定化细胞生产手性L-苹果酸及L-丙氨酸的生产成本均比相应的游离细胞生产工艺有较大幅度的降低。

2.2 非水相介质中的酶催化技术

传统的酶催化反应主要在水相中进行,但1987年Kilibanov（9-10）等用脂肪酶粉或固 定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽以及手性的醇、脂和酞胺 以来,对酶在非水相介质的催化反应技术的开发及研究报道迅速增加（10-11）,特别在手性药物的不对称合成及手性药物拆分的生物技术开发中得到了很多应用。目前 非水相中的酶催化技术已衍生出以下几类体系:①水与有机溶剂的互溶均相体系;②水与有机溶剂形成的两相或多相体系;③单相有机溶剂体系;④反胶束体系;⑤超临界液体;⑥低温体系等。不同的介质体系都有各自的适用范围,研究在不同介质中的酶催化反应动力学及热力学平衡以及酶催化机制将对某一特定催化反应所需介质的筛选和使用起到十分重要的指导意义,樊可可和欧阳平凯在两相体系酶催化反应介质的选取方面做了很多的实验及理化研究,已初步归纳出经实验验证行之有效的两相体系中酶促肽键合成反应介质的筛选原则。

2.3 低共熔酶催化反应技术

在有机相中进行的酶催化反应,找到一个合适的有机溶剂,既要使它对反应底物有良好的溶解性而又不使酶失活,且对反应平衡移动有利常常是困难的;另外,大量的有机溶剂往往会造成对环境的污染,回收或处理有机溶剂需要增加成本。正是由于上述原因,90年代初由Vulfson等人首先报道了应用液固共存的低共熔体系来克服有机相中的酶催化反应技术的局限性。在不用任何溶剂的条件下,他们分别用固定化的枯草杆菌蛋白酶和胰乳蛋白酶将一系列氨基酸酯和氨基酞胺组成的低共熔底物体系催化合成了一系列的多肽化合物,产率超过80%。这一新型的酶催化反应体系与水相体系及有机相体系相比具有以下几个显著优点:①反应底物浓度高,反应速度快,产物收率高,副产物少,可较大幅度地缩短反应时间;②不用或极少用溶剂,减少对环境的污染,也大大减少了有机溶剂对酶催化活力及选择性的影响;③大大降低了产物分离及纯化的成本。因此低共熔酶催化反应被 认为是一项新型的清洁高效反应技术,现已在多肽化合物、脂、手性化合物的拆分及特殊表面活性剂的制备上得到了应用（12-15）。然而,严格按照物化概念上构成低共熔反应底物体系还是非常困难的,体系也十分有限。vulfson等人（15）在上述工作的基础上提出通过加入极少量的助溶剂(有机或无机成分)形成多组分低共熔体系或拟低共熔体系来克服上述困难。沈树宝等人（16）通过筛选合适的助溶剂,用嗜热蛋白酶在拟低共熔状态下催化合成了阿斯巴甜前体—节氧拨酞天门冬氨酞苯丙氨酸甲酯(zAPM),其产物收率高达95%,明显优于文献中用两相体系合成zAPM的结果;而且反应时间仅需2h,是用两相体系方法所需时间的25%。目前,南京化工大学国家生化工程研究中心还在将该技术推广到多肽药物的合成及蔡普生手性药物的拆分和DL-氨基酸的拆分上。值得一提的是利用低共熔酶促反应技术对手性对映体化合物的酶法拆分要比常规的酶法拆分在对映体的选择性上有较大的提高,从而可提高产品的光学纯度（17）。

2.4 酶催化反应与分离的祸合技术

为了克服酶催化反应中底物或产物浓度较高时可能对反应生的抑制作用,及加快反应向生成产物方向移动,将酶催化反应与某种合适的分离过程相藕合是一个十分有效的手段,可大大提高产物收率,降低原料消耗。因此酶催化反应与分离祸合 技术已成为当今酶催化技术中的一个研究热点。胡永红等人（18-19）在用酶催化转化法生产L-苹果酸时,应用在生物反应器内原位结晶分离产品的方法,实现了酶催化反应与分离的有效祸合,使反应底物富马酸的转化率达99.9%,生产成本大幅降低;而且这种藕合不需要增加设备投资,工艺简单便于操作。徐虹等人（20-21）也在L-丙氨酸酶法生产中使用了类似的反应与分离技术,也同样取得了良好的结果,对L-天门冬氨酸的转化率近100%,最终L-丙氨酸的收率达90%。

3、酶催化技术在医药工业的应用

3.1 在制药工业中的应用

应用酶催化技术可以生产许多成品药及医药中间体。它是通过以制造初级代谢产物、中间代谢产物、次级代谢产物及催化转化和拆分等形式来进行的。这已成为当今新药开发和改造传统制药工艺的重要手段,特别在手性药物及中间体的生产中更有广泛的应用前景。以下重点介绍几个制药领域中酶催化技术的应用:

（1）氨基酸（22） 化学合成的氨基酸均D,L混旋型产物,药效差。50年代以来猪肾和米曲氨基酰化酶已被用来拆分乙酰-D,L-氨基酸。1969年日本田边制药会社成功地利用固定化酶催化技术连续拆分D,L-氨基酸,生产L-氨基酸和乙酰-D-氨基酸,乙酰-D-氨基酸用化学消旋后再在固定化酶柱上拆分大量生产L-苯丙氨酸、撷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和丙氨酸。日本左右田等以α-酮酸为起始原料,在D-氨基酸转氨酶、谷氨酸消旋酶、谷氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶这4种酶的作用下,开发了D-氨基酸的合成方法。南京化工大学国家生化技术工程中心则成功地利用较廉价的α-苯丙酮酸,通过转氨酶等催化生产L-苯丙氨酸并联产副产物丙酮酸。Kula等（23）开发了酶拆分一原位连续再生辅酶系统一膜分离藕合工艺,可自动化控制及扩大规模生产L-氨基酸。南京化工大学国家生化工程研究中心成功地利用多酶系统从D-对羟苯海因转化合成D-对羟苯甘氨酸,目前正在开发与膜分离相结的新工艺,他们还开发了酶法与原位结晶分离藕合技术生产L-丙 氨酸的新工艺,并已成功进行了工业化生产。

（2）有机酸 酶催化已用于柠檬酸、L-苹果酸、L-酒石酸、L-乳酸等多种具有光学活性有机酸的生产。胡永红等将酶催化与原位结晶分离技术祸合生产L-苹果酸,底物的转化率接近100%,大大降低了生产成本。

（3）抗生素 多种青霉素酰化酶(如6-氨基青霉烷酸、氨苄青霉素和羟氨青霉素)、头孢菌素酰化酶(如7-烷基头孢烷酸)、链霉素等都是酶催化技术应用大规 模抗生素工业生产的实例。

（4）肽类药物 酶催化肽键合成可用来生产许多种多肽药物,如胰岛素、环孢菌 素A等。酶催化合成甜味二肽是最为成功的例子。

3.2 在临床诊断及治疗上的应用（1）

固定化的细胞和酶在临床诊断及治疗上已得到了大量的应用,首先固定化酶技术可用于治疗一些代谢障碍疾病。已知人类关于新陈代谢的疾病已超过120余种,很多病因归结为人体缺乏某种酶的活性,一种可能的治疗方法就是通过某种方式给病人提供他所缺乏的酶。其提供的方式主要有:①将固定化酶用于体内作为治疗药物;②将固定化酶组装成体外生物反应器,通过体外循环作为临床治疗剂。将 固定化酶用于临床诊断的例子很多,如各种酶测试盒层出不穷,采用固定化酶柱反应器的IFA(流动注射法)可用于临床诊断检测尿酸、葡萄糖、氨、尿素、谷氨酸、乳酸、无机磷等。

参考文献

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