第1章 仪器结构和原理

流式细胞技术是一种定量分析技术。定量测量在细胞生物学中之所以重要，是因为要想鉴别出一个细胞群体，主要是依据细胞特殊标记物的数量，而不仅是依据标记物的存在与否。多参数相关分析可以对细胞固有的性质，例如光散射的测量与定量测定细胞的特征如表面受体、和DNA同时进行。当然，必要时还可同时再测定胞浆内抗原、核内抗原等等。这样，就有可能从一个复杂的细胞混合体中，识别出某一个特定的细胞亚群。由于只有对大量的细胞进行测量才能发现稀有的亚群并把它分选出来，所以快速测量是必需的。这里所谓分选即流式细胞分选术，是根据所测定的各种细胞性质的不同组合，从细胞群体中将某个亚群分选出来，以对它进行功能研究、形态学研究、进一步培养或做其它的分析。

本公司是生产流式细胞仪的主要厂家，我们生产了一系列台式和落地型的流式细胞仪，并研发生产了FCM所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。台式机（FACScan、FACSort、 FACSCalibur等）易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室中应用。落地型机器(如FACSAria、FACSVantage SE、FACSVantage Diva等) 具有快速分选功能，功能齐全，分析灵活，适合基础科学与生物医学研究。我们此次主要介绍台式机的结构及其工作原理。

2.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪一般都包括液流系统、光学系统和电子系统，某些机型还可选配分选系统。待测样本中的细胞经液流系统传送依序地通过流式细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发产生信号，被信号接收器接受并放大，这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的平衡缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过激光照射区 (液柱与入射的激光束垂直相交点称为检测区)，被荧光染色的细胞受强烈的激光照射后发出各色荧光，同时产生光散射。荧光信号由与激光束垂直的90度方向通过光学系统（透镜、光栏、滤片和光检测器等）收集。荧光和侧向角散射光检测器是光电倍增管，前向角散射光检测器是光电二极管。

在前向小角（2-10度）进行检测的散射光信号称为“前向角散射光”。这种光散射信号反映了细胞的体积。细胞发出的荧光信号和光散射信号同时被90度角方向的荧光光电倍增管和前向光电二极管接收，被放大积分后转换为电子信号输入多道（1024道）脉冲高度分析仪，并在计算机屏幕上，以一维直方图、二维位图、或三维图形显示出来。或将图形和数据直接输入联机专用的计算机，或存入磁盘以备分析。计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞定量分析。

2.2 液流系统

液流系统的主要功能是将细胞依序送到测量区（流动室）接受检测。

2.2.1 流动室（Flow Cell）

台式机多采用密闭式液流系统，因此液流压力与鞘液流流速皆为原厂预设，需要人为调整，故而操作简单。加上仪器内之激光光路亦为原厂预先调设，因此较适用于临床检验与基础科研。

流动室(Flow Cell)是仪器核心部件，由石英玻璃制成，被测样品在此与激光相交。这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。

流动室是样品与鞘液相互混合的小室（参见图例）。流动室内充满鞘液，样品试管中的细胞被一高于整个液流系统的压力推入流动室中，与鞘液相混后，经由流动室中心之微细水路向上游动，鞘液则在此时包被水路，并藉由流体原理，使细胞能以单一细胞之形态，逐一流经最窄的水路到达测量区，而与激光光交会。常使用的鞘液流为等张溶液如phosphate-buffered saline，若配合特殊实验可改用无菌的细胞培养液。

2.2.2 控制样品的流速

实验样品的检测速度可以通过改变样品试管中的压力来控制，仪器面板中有三种预设样品的流速；高速为每分钟60微升，中速为每分钟36微升，低速为每分钟12微升。改变样品的检测速度会影响细胞向上游动的水路的直径大小，同时影响实验数据的变异系数。高速时水路的直径大，受测细胞可偏离水路中轴，或左或右移动而增加变异系数。这一现象在某些要求低变异数的实验中，需要避免，如做DNA分析时流速必须较低，控制在每秒两百个细胞左右可达到较佳的结果；一般做淋巴细胞表面抗原分析时则无流速限制，可以高达每秒上千个细胞，而无损仪器辨识力。

2.3 光学系统

仪器中含有一系列光学元件，包括激发光源、透镜、光栅和滤片等，它们的主要功能是产生并收集荧光、光散射等信号。

2.3.1激光器

激光基本沿着直线传播，发散角小，很容易聚焦到与细胞同一数量级。激光的亮度高，即在单位面积、单位立体角内输出功率特别大。激光还具有良好的单色性，这些特点使激光成为细胞仪光源的首选。FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子激光器。氩离子激光器也是目前最常被使用在流式细胞仪中的光源。

FACSCalibur可选配第二根气冷式激光器，产生之635 nm波长之红色光束，配合APC、TOTO-3、TO-PRO-3等红光激发染料的使用（见表一），可应用于四色荧光之分析。用双激光光源的仪器扩大了其分辨的标记信号范围和种类。

2.3.3 滤片

流式细胞仪中所用的滤片有很多种，有带通滤片、长通滤片、短通滤片等。长波通滤片只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的光线滤掉，如650nm 长波通滤片只允许PerCP发射的红色荧光通过，而488nm的激发光及FITC发射的525nm绿光全部被阻。带通滤片的应用则正好相反，它只允许某一特定波长的光线通过，例如一530 nm带通滤片只允许FITC发射的530 nm绿色荧光通过，而其它波长的荧光全部被阻断。

FACSCalibur 基本配备有 (1) 带通滤片：488/10, 530/30, 585/42 Bandpass （四色机型： 661/16）。 (2) 长通滤片：650 Longpass (四色机型：670 LP) 。(3) 长波通二色性反射镜：DM640 LongPass。 (4) 短波通二色性反射镜：DM560 ShortPass。同时，测定侧方散射光时，加用双向分色滤片（Dichromic 90/10 beam splitter）。图示FACSCalibur流式细胞仪中滤片的基本设置。

2.4 电子系统

电子系统主要有三个功能：(1) 将光学信号转换成电子信号。 (2) 分析所输出的电流信号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。 (3) 量化信号并传至计算机。

2.4.1光电探测器（Photodetectors）：

光电探测器的用途是将光学信号转换成电子信号。FACSCalibur细胞仪使用两类探测器：硅晶光电二极管及光电倍增管（PMT）。光电二极管与光电倍增管各有其优点，光电倍增管在光线较弱时有很好的稳定性，而当光线很强时光电二极管就比光电倍增管稳定，所以FACSCalibur在探测FSC时用光电二极管；在探测荧光与SSC时，由于光信号较FSC弱得多，所以探测器灵敏度是主要因素，必须使用光电倍增管。

光电倍增管接收外来的光子信号并释出光电子，利用磁场将光子撞击到倍增电极上释出电子，再撞击到下一个倍增电极产生更多的电子，经过这一连串的撞击能放大并产生相当多的电子，最后再以阳极收集最终所有的电子，并产生输出电流信号。使用光电倍增管的优点除了可提高光信号之外，真正信号与噪声之比值也较高。

2.4.2 信号的产生及处理

光电二极管及光电倍增管所输出的电流信号，经由初步放大器（pre-amplifier）转换成电压，再经由主波放大器（main pulse amplifier）将所需之信号放大与处理（参见图）。信号的放大可以使用线性（linear）或对数（logarithmic）两种型态，一般前向及侧向角散射光光的信号使用线状放大，因为散射光变异范围较小；而由于荧光信号变异范围较大，所以多使用对数放大，唯一例外的是DNA分析时是使用线性放大，因为希望维持荧光信号与DNA含量的正比关系。

2.5 散射光的测量

在流式细胞仪中，从光的散射信号可以得到非常有价值的数据，因为细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性，所以可以用散射光的信号对未染色的活细胞进行分析。细胞在液流中通过测量区时，经激光照射，细胞向空间360 度角的所有方向发射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、质膜、和细胞内部的折射率有关。在流式细胞术中常用的有前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC），前者亦称0度角散射，后者亦称90度角散射。

2.5.1 前向角散射光（FSC）

前向角散射光亦称小角散射或0度角散射。一般我们仅能说前向角散射光的强度与细胞的大小有关。对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些；而散射光弱的，其细胞小一些。究竟更准确的关系是什么，因细胞不同、处理方法不同、固定方法不同，以致我们无法讲出更精确的结论。甚至当细胞是非球形的如鸡红血球、扁平状的精子时，由于细胞在液流中空间取向的不同，也可导致对同型细胞测得的前向角散射光信号完全不同，这是必须注意的。

2.5.2 侧向角散射光（SSC）

侧向角散射光亦称90度角散射或大角散射，收集到的是细胞通过测量区时侧方向的散射光。侧向角散射光的强度与有关细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。当然，侧向角散射光光也与细胞形状、大小有关，但这不属于侧向角散射光获取数据的主要方面。

以上所有的散射光与入射光波长一致，这是散射光与荧光的最大不同之点。散射光的探测器可以是硅光二极管，也可以是光电倍增管，前者多用于探测前向角散射光，后者用于探测侧向角散射光光。在实际使用中，仪器首先是对光散射信号进行测量。因为通过测量区的每个细胞不管它是否已被染色都能散射光线，所以光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色的细胞和未染色的细胞，光散射测量最有效的用途，是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。用前向角散射和侧向角散射光双参数测定，可从不加任何染料的小鼠全骨髓中鉴别出若干个亚群。举例而言，流式细胞仪可依据光散射信号将人白细胞分成三个亚群，淋巴细胞，单核细胞与粒细胞：淋巴细胞FSC与SSC都小，单核细胞FSC大与SSC中等，而粒细胞FSC与SSC都大。

2.5.3 电压阀值的设定

由于流式细胞仪的高敏感度，只要溶液中稍有杂质就很容易产生一微小电压信号，所以必须设定电压阀值（threshold voltage），所有进入的信号必须高于此阀值才被接收为信号，操作者一般对前向角散射光设定阀值，来排除杂质或细胞碎片或体积变小的死细胞。

2.5.4 线性测量和对数测量的选择

散射光测量时通常使用线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，输入增大1倍，输出也增大1倍。线性放大器适用在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号。前向角散射光和DNA测量即属于这一类。但测量中有时需要用对数放大器，它的输出与输入是对数关系。如果原来输出为l，当输入增大到原来的10倍时，输出是2；当输入又增大10倍时，输出为3，等等。如侧向角散射光光由于信号大小变化范围较大，有时用对数放大器可能好一些。

2.6 荧光测量

当一个物体受到光能激发后，物体中的电子达到高的能阶（激发状态），当它回复到原有的状态时，多余的能量就以光的形式辐射出来。这就是说当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发射出比原来吸收的波长更长的光的特性，这种现象称为〝荧光〞。

2.6.1 荧光测量的意义

荧光信号可以反映不同的细胞生物学特性。如用荧光染料标记的单克隆抗体特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白结合，在激光的激发之下，发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量，对荧光信号进行收集分析，就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。用DNA染料对DNA进行染色，染料通过一定方式与DNA链接合，在激光的激发下，染料发出荧光，测定荧光的强度，就可得出相对DNA的含量，进而可对细胞周期时相进行分析。用特定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内pH值以及细胞膜电位等进行测定。

2.6.2 荧光染料的选择

选择荧光染料的依据就是要了解仪器的光源系统，同时考虑染料的激发光谱。激发光波长应尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值。

2.6.3探测器的选择

仪器在同时检测多种荧光时，每个荧光检测器只允许一种指定波长的荧光信号进入而被检测，因此使用者必须选用适当的荧光信号接收器，才能收到最佳的信号。选择检测器的依据就是要了解荧光染料的发射光谱。以三色FACSCalibur为例，如果荧光光谱峰值落在绿色范围（515-545 nm波长），选用第一荧光检测器；如果光谱峰值落在橙红色范围（564-606nm），选用第二荧光检测器；如果荧光光谱峰值落在深红色范围（>650nm），选用第三荧光检测器。

表一、常用荧光染料之光学特性

2.6.4线性测量和对数测量的选择

荧光测量常使用对数放大器。因为在免疫学的一个样品中、可能有的细胞未被染色仅有自发荧光，为阴性群体；被染上色的细胞特异性荧光可能比自发荧光强数倍到数十倍，是为阳性群体；有时还会有一些被染色的细胞，其荧光比自发荧光强数百倍。是为强阳性群体、对同时具有以上数种亚群的样品，当需要同时显示时，如用线性放大器，三个群体的荧光将难同时显示，而用适当对数放大器则同时可分辨出这些亮度差异极大的三个或更多个亚群。此外，在使用对数放大器时，被染色的细胞群体有倾向于对称性分布的趋势，这对于选定不同亚群间的分界点十分有利，这对于使用流式细胞仪进行分析和分选都不无好处。只有少数特殊荧光的测量，会建议使用线性放大器，如 DNA 分析。

2.6.5 荧光补偿的调节

用一种激光束激发两种荧光染料而发射多种不同波长的荧光时，从理论上讲可选择滤片系统仅使一种荧光被一个光电倍增管检测，此光电倍增管不会检测到另外一种荧光。但实际上由于两种 荧光的发射光谱的重迭，因而少量不需要的另一种荧光也会为此光电倍增管所检测，所以每一个光电倍增管实际上检测到的都是两种荧光之总和，只不过各以某一个为主而已。

如何从所接收的荧光信号中，把不需要测定的部分减去，使光电倍增管输出的信号真正只代表指定欲检测的信号，这可用电子补偿线路来完成。即在放大线路中加进一个补偿电路。使之能减去进入光电倍增管不需要测定的荧光信号。补偿的深浅程度，可用双荧光同时测定的仪器条件来决定。补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电涪增管例如PMT1有信号输出外，另一光电倍增管PMT2也常会有微弱的输出，调节补偿器使PMT2输出为0，然后再测另一种染料，再调PMT1补偿器使之输出亦为0、如此反复调节，则PMT1和PMT2就可全获补偿。此后如PMT的高压改变、激光波长变动，滤片系统有变化时需重新调正。

Uncompensated Over-compensated Just-make

第1章 流式的工作原理