免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测

摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。

关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清 抗体效价 免疫

实验过程：

本次实验一共分为三个分实验：

实验一：免疫

实验二：抽血、放血，分离抗血清

实验三：ELISA测定抗体效价

实验一：免疫

一、抗血清制备的原理

用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

二、目的

制备高效价的抗血清

三、实验仪器、材料和试剂

实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀

材料：家兔，小鼠

试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)

三、方法和步骤

1、动物编号

左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

2、动物抓取及注射按

如下图所示抓取目标动物

家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。

小鼠腹腔注射

以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推?0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。

兔子可以分别尝试皮下（脚掌）、皮内、耳静脉、肌肉注射

实验二：抽血、放血，分离抗血清

一、采血

小鼠采血

（一）、尾部采血：需血量少时可用此方法。将小鼠放在在有开孔的离心管内，显露尾部，将尾端剪去约 5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。

（二）、小鼠睚眦采血：将毛细管折断，使其断口锋利。采血时，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。用毛细管的断口，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约 2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2—0.3 ml，大鼠一次可采 0.5—0.1ml。

家兔的采血

（一）、耳静脉抽血：将家兔置于兔固定箱内，对家兔进行耳静脉抽血，此法用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决定加强免疫或放血，与耳静脉注射方式相反。

（二）、心脏抽血：家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。

（三）、颈动脉放血：家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。

注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！！！

二、抗血清的分离，保存

1、斜置装血液的三角瓶0.5-1h；

2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；

3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；

4、次日：估计分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。

实验三：酶免疫吸附试验法（ELISA）测定抗体效价

一、ELISA原理

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。

二、实验仪器、材料、试剂

仪器：酶标板，酶标仪、保鲜膜、排枪

材料：牛血清白蛋白（BSA)—— 抗原，10 μg/ml溶液，包被液配制

鼠抗BSA—— 待测抗体样品，用PBST从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度

HRP标记羊抗小鼠IgG —— 二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。）

试剂：包被缓冲液：0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）

0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）

PBST洗涤液：含0.05 % Tween 20的0.01 M 的PBS（ pH 7.4 ）

底物溶液：TMB（ 3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）

2M H2SO4 （市售浓硫酸为18.4 M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）

三、实验方法和步骤

1.加抗原：取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）

2.包被抗原：保鲜膜包好， 37℃ 1h或4 ℃过夜（抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上）

3.封闭：甩干后以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次，每孔加入100 μl 5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。保鲜膜包好， 37℃， 2h后（封闭的目的：降低背景干扰，避免假阳性），取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体。以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次

4.加待测血清：标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔（用PBST稀释，按示意图用单枪加）。37℃，保鲜膜包好，60min后甩干孔内液体

5.加二抗：以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次。各孔加入酶标二抗100μl/孔，37℃，保鲜膜包好，45min后，甩干孔内液体

6.显色：以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次。加入TMB底物溶液50μL/孔，避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50 μl 的2M 硫酸终止反应

7.结果分析

在酶标仪上，于450nm处测各孔OD值。阴性无色，OD小于0.1；阳性黄色，3个重复的平均值大于0.2，且为阴性对照OD值的2.0倍。

打开“酶免大师”，登录密码“1234”，设置参数，选“终点法检测”，建微板，点击“read”，等待读取各孔OD值，导出。

结论：

由于实验动物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫还可以，初步判断抗原效价为一价。未免疫家兔的血清测定的OD值很小，说明实验材料没有很大的污染。

穿插实验;玻片法—血型鉴定

实验材料：

1、Ag：受检血样（红细胞悬液）

2、Ab：标准抗A血清、标准抗B血清（单克隆抗体，不同于标准A型血清、B型血清）。

实验方法和步骤：

1、受检抗原（血样）制备：

用酒精棉球消毒手指---待干后用无菌5#针刺消毒部位---取一滴血（大绿豆大小）于盛有0.6ml生理盐水的离心管中，混匀。

2、加标准诊断血清到受检血样中，血型判定：

取干净6孔白瓷盘一块（两人用），三孔先各加一滴血样---前两孔分别加入一滴抗A、抗B鉴定血清---用两根无菌牙签分别对前两孔进行混合，水平摇动---2min后观察结果。

实验结果分析

免疫学实验报告