一 目的

建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

二 范围

本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。

三 内容

1.1 试验菌株

大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]

黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]

1.1.1 标准菌株

1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。

1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。

1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。

1.1.2 工作菌株

1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。

1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。

1.2 菌种确认试验的主要内容

1.2.1 菌种的纯度确认

1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

1.2.1.2 试验内容

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

1.2.2 菌种的特性确认

1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。

1.3 菌种的确定方法

用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。

1.3.1 大肠埃希菌的确认

1.3.1.1 菌落形态

1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。

①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。

②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

1.3.1.2 革兰染色、镜检

1.3.1.2.1 革兰染色

①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。

②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。

⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。

1.3.1.2.2 染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。

1.3.1.2.3 镜检结果应是：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。

1.3.1.3 生化试验

1.3.1.3.1 靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

1.3.1.3.2 甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

1.3.1.3.3 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。

1.3.1.3.4 枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2-4天，培养基斜面有菌苔生成，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。

1.3.1.3.5 乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。

1.3.2 金黄色葡萄球菌的确认

1.3.2.1 菌落形态

1.3.2.1.1 取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。

1.3.2.1.2 取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板和卵黄氯化钠琼脂平板上培养24～27h观察结果。

①甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环,菌落直径0.7-1mm。

②卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解 的乳浊圈，菌落直径1-2mm。

1.3.2.2 革兰染色、镜检

1.3.2.2.1 革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）

1.3.2.2.2 镜检结果：为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，菌体大小不一。无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。

1.3.2.3 生化试验

1.3.2.3.1 血浆凝固酶试验

试管法：取无菌试管（10mm×10mm）2支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液（1：1）0.5ml，1支加入营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照：另一支加入无菌营养肉汤0.5ml作为阴性对照。两管同时置37℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察。

①阳性对照管：血浆和无菌水混合液加金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物，在3h后开始观察直至24h。结果：血浆凝固。

②阴性对照管：血浆和无菌水混合液加稀释液，在3h后开始观察直至24h。结果：血浆流动自如。

1.3.3 枯草芽孢杆菌的确认

1.3.3.1 菌落形态

1.3.3.1.1 取枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈浑浊生长。

1.3.3.1.2 取上述培养物划线接种于营养琼脂平板上，培养24～27h观察结果：菌落为灰色、干燥、皱缩、无典型卷发状。

1.3.3.2 革兰染色、镜检

1.3.3.2.1 革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）

1.3.3.2.2 镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

1.3.4 白色念珠菌的确认

1.3.4.1 菌落形态

1.3.4.1.1 取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，呈浑浊生长。

1.3.4.1.2 取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72 小时）观察结果：呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。

1.3.4.1.3 取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72 小时）观察结果：平板上为绿色或翠绿色的菌落生长。

1.3.4.2 革兰染色、镜检及芽管试验

取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48h。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。

1.3.4.2.1 革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）

1.3.4.2.2 芽管试验：挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃培养1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。

1.3.4.2.3 镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢子、菌丝、芽管。

1.3.5 黑曲霉菌的确认

1.3.5.1 镜检：可见孢子，菌丝。

1.3.6 铜绿假单胞菌的确认

1.3.6.1 取铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。

1.3.6.1.1 取上述培养物接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养18～24h后，观察结果：呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。

1.3.6.2 革兰染色、镜检

1.3.6.2.1 革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）

1.3.6.2.2 镜检结果：铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌。单个，成对或成短链排列。

1.3.6.3 氧化酶试验

取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单孢菌。否则，应进行绿侬菌素试验。

1.3.6.4绿侬菌素(Pyocyanin)试验

取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3~5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿侬菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDF琼脂培养基斜面同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阳性，判断供试品检出铜绿假单胞菌。上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

1.3.7 生孢梭菌的确认

1.3.7.1 取生孢梭菌新鲜培养物2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接后处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48~72小时。若平板上有菌落生长，应选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

1.3.7.2 革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）

1.3.7.3 过氧化氢酶试验

取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶试验阴性，判断供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。

标准菌种确认标准操作规程