小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1. 实验材料与试剂

剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等

试剂配比：

(1) DMEM 10:10:1

DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)


(2) DMEM 5:5:1

DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S


(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子）

25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS

DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)
Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+

2.实验步骤

2.1星形胶质细胞的混合培养

取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2星形胶质细胞的分离和纯化

将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/L PBS 洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶，37℃ 消化15 min 左右，至镜下观察到大部分星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培养基中止消化，1000 r/ min离心5 min，再用PBS 洗2 遍后，重悬于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，种于培养瓶中; 将培养瓶置于37℃细胞培养箱稳定贴壁1 d 后，再用37℃恒温定轨摇床，200 r/min 振摇2 h;吸取上清液弃去(其中主要包括一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞) ，贴壁细胞采用0. 25% 胰酶37℃ 消化后立即置于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，终止消化后,1000 r/ min离心5 min，弃上清，将沉淀细胞重悬于含10%FBS的DMEM/F12 培养基，计数后调整细胞密度106 /孔接种于6 孔培养板中，稳定24 h 后可用于后续实验。

2.3星形胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定

本实验建议选择OX42作为小胶质细胞的标志物, 能同时反映小胶质细胞的激活状态，以OX42抗小鼠CD11b/c抗体免疫荧光染色法鉴定星形胶质细胞。

具体步骤:

(1)待小胶质细胞长成片后, 取出盖玻片, 依次用PBS液清洗3次,每次5 min, 冰丙酮固定15 min, 干燥5 min, PBS漂洗3 次;

(2)特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min，进行抗体标记。

(3)洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。

(4)加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。

(5)封片：封片剂封片。

(6)镜检：荧光显微镜下观察，胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。

注意事项

1、选材注意选取新生小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。

2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。

3、应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。

5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。

6、传代培养细胞接种量为1×106 个（25 cm2 培养瓶），细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案