靶向人端粒酶逆转录酶进行ＲＮＡｉ的逆转录病毒载体的构建王全师１，王欣璐２，李华３，王巧愚１，王全颖４，杨广笑４（１南方医科大学南方医院ＰＥＴ中心，广东广州５１０５１５；２广州军区广州总医院核医学科ＰＥＴ中心，广东广州５１００１０；３中山大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；４西安华广生物工程公司，陕西西安７１００２５）摘要：目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰ＲＮＡ的真核表达载体。方法采用ＰＣＲ法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的ＤＮＡ序列、Ｕ６启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰ＲＮＡ对应的ＤＮＡ序列，随后将与之相应的ＤＮＡ序列片断依次克隆入真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达ＥＧＦＰ蛋白的情况。以ＭＴＴ方法检测初步分析重组病毒对人Ｈｅｌａ细胞的ＲＮＡｉ效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰ＲＮＡ的逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ／ＥＧＦＰ－Ｕ６－ｓｉＴＥＲＴ。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后，重组病毒感染人Ｈｅｌａ细胞２４ｈ时用流式细胞仪测得ＥＧＦＰ表达的阳性率为２４．１％。重组逆转录病毒感染人Ｈｅｌａ细胞４８ｈ时，ＭＴＴ实验测得细胞死亡率为５３．２％。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰ＲＮＡ的逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ／ＥＧＦＰ－Ｕ６－ｓｉＴＥＲＴ，并制备了重组逆转录病毒，初步观察了效应，为进一步利用小干扰ＲＮＡ技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。关键词：ＲＮＡ干扰；逆转录病毒载体；人端粒酶逆转录酶中图分类号：Ｒ３７３．５文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４２５４（２００６）１２－１７１５－０５ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｆｏｒＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＷＡＮＧＱｕａｎ－ｓｈｉ１，ＷＡＮＧＸｉｎ－ｌｕ２，ＬＩＨｕａ３，ＷＡＮＧＱｉａｏ－ｙｕ１，ＷＡＮＧＱｕａｎ－ｙｉｎｇ４，ＹＡＮＧＧｕａｎｇ－ｘｉａｏ４１ＰＥＴＣｅｎｔｅｒ，ＮａｎｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｃｈｉｎａ；２ＰＥＴＣｅｎｔｅｒｏｆＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＣｏｍｍａｎｄ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００１０，Ｃｈｉｎａ；３ＴｈｉｒｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｕｎＹａｔ－ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４Ｘｉ＇ａｎＨｕａｇｕａｎｇＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｘｉ＇ａｎ７１００２５，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｆｏｒＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｄｉｎｇｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ），Ｕ６ｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄａｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｔａｒｇｅｔｉｎｇｈＴＥＲＴｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｓｕｂ－ｃｌｏｎｅｄｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙｉｎｔｏｔｈｅｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｓｈｕｔｔｌｅｐｌａｓｍｉｄｐＬＸＳＮｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｐＬＸＳＮ－ＥＧＦＰ－Ｕ６－ｓｉＴＥＲＴ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅＥＧＦＰｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄＭＭＴａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨｅｌａｃｅｌｌｓｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｐｌａｓｍｉｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＬＸＳＮ－ＥＧＦＰ－Ｕ６－ｓｉＴＥＲＴｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｏｕｒｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｆＥＧＦＰｒｅａｃｈｅｄ２４．１％ａｓｓｈｏｗｎｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＭＴＴａｓｓａｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄａｃｅｌｌｄｅａｔｈｒａｔｅｏｆ５３．２％７２ｈａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｌａｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｓｍｉｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｐｌａｓｍｉｄｍｅｄｉａｔｉｎｇｐｏｔｅｎｔｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈｅｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇｈＴＥＲＴｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ；ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是生物界中一种古老而且高度保守的现象，是基因转录后沉默作用（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧｓ）的重要机制之一。它能依赖短ＲＮＡ引导序列介导特异性核酸酶识别并降解靶基因内源性ｍＲＮＡ，在转录后水平干扰基因表达［１－４］。本研究设计构建了针对端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔ，ｈＴＥＲＴ）的特异性ｓｉＲＮＡ的真核表达载体。ｈＴＥＲＴ是端粒酶活性的主要决定因素，收稿日期：２００５－１０－２０基金项目：国家自然科学基金（３０３７０４２６，３０５００１３６），广东省科技计划项目（２００３Ｃ３２７２９）；广东省自然科学基金（０６０２１３５２）ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（３０３７０４２６，３０５００１３６），Ｓｃｉ－ｔｅｃｈＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（２００３Ｃ３２７２９），ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（０６０２１３５２）作者简介：王全师（１９５９－），男，副主任医师，博士，电话：０２０－６１６４２１２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｑｓｌｐｈ＠１６３．ｎｅｔ通讯作者：王欣璐，电话：０２０－８７７９５０６１，Ｅ－ｍａｉｌ：７１ｌｕ＠１６３．ｃｏｍ２００６；２６（１２）南方医科大学学报（ＪＳｏｕｔｈＭｅｄＵｎｉｖ）１７１５・・

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建