专题二 微生物的培养与应用

微生物的培养过程及分离和计数

例1 （2008年济南模拟）某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题。

（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是 和 。

（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。

（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种 作为对照进行实验。

（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有 种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 。

（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 细菌，这种培养基被称为 。

答案 （1）氮源（碳源不作要求） 碳源 无机盐 水

（2）高压蒸汽灭菌 （3）恒温培养箱 无菌水

（4）多 高 （5）盐（或NaCl） 选择培养基

选择培养基的用途

例2 某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌和酵母菌混在一起，请你设计实验分离得到纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌。

（1）实验原理：

。

（2）材料用具：配制培养基所需要的各种原料、无菌操作箱、接种环等。

（3）简述主要步骤：

①制备两种培养基，一种是 培养基；另一种是 培养基。分别分成两份，依次标上A、a、B、b备用。

②分别向A、B培养基中接种混合菌。

③接种后，放在恒温箱中培养3～4 d。

④分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌，分别接种到a、b培养基中。

⑤接种后，把a、b培养基再放入恒温箱中培养3～4 d。

（4）实验结果：在a、b培养基上获得的分别是 、 。

（5）回答问题：

步骤④、⑤的目的是 。

答案 （1）圆褐固氮菌是自生固氮菌，能在无氮培养基上生长繁殖，而酵母菌则不能；青霉素不影响酵母菌等真菌的生长繁殖，而会抑制圆褐固氮菌的生长繁殖

（3）无氮 加青霉素

（4）圆褐固氮菌 酵母菌（顺序根据学生答题的具体情况）

（5）获得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌

1.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：

（1）对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料： 、

、 、 、 。其中提供氮源的是 ；提供能源的主要物质是 。

（2）微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停地 ，防止 。

（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌，压力 kPa，温度 ，时间 。灭菌完毕后拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。

（4）使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入 ，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。

（5）从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要用酒精灯 （“内”或“外”）焰灭菌，并且待接种环 后

蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管放入 ℃冰箱中保藏。

答案 （1）牛肉膏 蛋白胨 水 无机盐 琼脂 蛋白胨、牛肉膏 牛肉膏 （2）比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂

（3）高压蒸汽灭菌锅 100 121℃ 15～30 min 废弃 （4）适量水 （5）外 冷却 4

2.选择培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。选择条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面，下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。

（1）本实验所需培养基为 ，碳源为 。

（2）实验原理是

。

（3）①→③重复培养的目的是 。

（4）⑤的菌落中大部分是降解 的微生物。

（5）⑥为 组，⑦为 组，设置⑥的目的是 。

（6）⑤→⑥采用 法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是

。

答案 （1）选择培养基 对羟基苯甲酸

（2）利用以对羟基苯甲酸为惟一碳源的选择培养基，经选择培养，选择出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物

（3）增大分解对羟基苯甲酸微生物的比例

（4）对羟基苯甲酸

（5）对照 实验 说明通过选择培养的确得到了欲分离的目标微生物

（6）单菌落挑取 接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环在空气中冷却，同时打开皿盖挑取菌落接种到试管中，并塞好棉塞，最后接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物

3.（热点预测）为了研究微生物的抗药性突变是自发产生的还是在环境因素的作用下产生的，1952年Lederberg夫妇利用大肠杆菌设计了一个影印培养法实验。

影印培养法的实验原理是：把长有数百个菌落的细菌母种培养皿倒置于包有一层灭菌丝绒布的木质圆柱体（直径略小于培养皿平板）上，使其均匀地沾满来自母种培养皿平板上的菌落，然后通过这一“印章”把母板上的菌落“忠实地”一一接种到不同的其他培养基上。

下图就是利用影印培养技术证明大肠杆菌产生抗链霉素突变基因的实验。具体方法是：

①首先把大量对链霉素敏感的大肠杆菌涂布在不含链霉素的培养基的平板1的表面，待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基平板2上，随即再影印到含有链霉素的培养基平板3上。经培养后，在平板3上出现了个别抗链霉素的菌落。

②对培养皿2和3进行比较，在平板2上找到与平板3上那几个抗性菌落的“孪生兄弟”。

③把平板2上与平板3上菌落相应的一个部位上的菌落挑至不含链霉素的培养液4中，经培养后，再涂布在平板5上。

④重复以上各步骤，最后在试管12中获得了较纯的抗性菌落。

根据以上材料回答下列问题：

（1）若要仅获得抗链霉素的大肠杆菌，则该如何操作： 。

（2）大肠杆菌抗链霉素基因存在于细胞的 结构上，在基因工程中，该结构常作 。

（3）3号、7号、11号培养皿中加入链霉素的作用是 ，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了

。

（4）该实验最关键的设计思路是 。

你认为该实验设计的巧妙之处是 。

（5）你认为该实验得到的结论是

。

答案 （1）将原始菌种涂布到含有链霉素的培养基中进行选择培养，生长出的菌落即为抗链霉素的大肠杆菌

（2）质粒 载体

（3）选择作用 通过链霉素的选择作用，具有抗药性的大肠杆菌保留下来，数量较少

（4）对照实验 最终获得的抗药性细菌一直没有接触链霉素

（5）微生物的抗药性突变是自发产生的，而不是在链霉素的作用下产生的

4.（2009年韶关模拟）如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答：

成分 含量

NaNO3 3 g

K2HPO4 1 g

KCl 0.5 g

MgSO4·7H2O 0.5 g

FeSO4 0.01 g

（CH2O） 30 g

H2O 1 000 mL

青霉素 0.1万单位

（1）依物理性质划分，该培养基属于 培养基；依用途划分，则属于 培养基。

（2）根据培养基的原料，所培养微生物的同化作用的类型是 ，培养的微生物可能是 。

（3）该培养基中的碳源是 。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是

和 ，倒平板时，一般需冷却至 左右，在 附近操作。

（4）若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的物质是 ，应加入的物质是 ，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入 ，形成 色复合物，若产生 ，则证明有纤维素分解菌存在。

答案 （1）液体 选择 （2）异养型 酵母菌或霉菌

（3）（CH2O） 调整pH 灭菌 50℃ 酒精灯火焰

（4）青霉素和（CH2O） 纤维素粉 刚果红 红 透明圈

5.人们常用琼脂培养基来培养微生物，它在加热后呈溶胶状态，在室温下又呈半透明的凝胶状态。在凝胶状态下，其表面及内部不同部位可生长大量的不同代谢类型的肉眼可见的细菌菌落。请用提供的材料和用具，设计一个实验来探究某种细菌的异化作用的类型。

（1）材料用具：某种细菌的菌种、含琼脂培养基的试管两支、无菌接种设备、恒温箱、水浴锅。

（2）实验步骤：

① ；

②在培养基冷却而凝固之前，

；

③ 。

（3）预测实验可能会出现的结果，并得出相应的结论。

① ；

② ；

③ 。

答案 （2）①将两支含琼脂培养基的试管置于水浴锅中加热溶化 ②用无菌接种设备将某种细菌菌种接种到一支试管中，振荡试管，使细菌均匀混于培养基中，另一支试管不接种作为对照 ③将两支试管置于恒温箱内培养，每天观察培养基中的菌落情况并做好记录 （3）①若只在培养基的表面生长有这种细菌的菌落，则说明它是需氧型细菌 ②若只在培养基的底部生长有这种细菌的菌落，则说明它是厌氧型细菌

③若培养基的表面和底部都生长有这种细菌的菌落，则说明它是兼性厌氧型细菌

6.（2009年茂名模拟）尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：

（1）此培养基能否用于植物组织培养？ ，理由是 。

（2）培养基中加入尿素的目的是筛选 ，这种培养基属于 培养基。

（3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和 ，实验需要振荡培养，原因

是 。

（4）转为固体培养基时，常采用 的方法接种，获得单菌落后继续筛选。

（5）下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养皿，②玻棒、试管、锥形瓶和吸管，③实验操作者的双手。其中需

要灭菌的是： ；需要消毒的是： 。（填序号）

（6）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。

A同学的实验结果产生的原因可能有 （填序号）

①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照

（7）实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。

答案 （1）不能 缺少植物激素（或缺少植物需要的各种营养） （2）目的菌 选择 （3）尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 （4）涂布平板（划线） （5）①和② ③

（6）①②③（答出两个给1分，全对给2分） （7）灭菌

7.（2009年聊城模拟）下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题：

实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。

材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。

方法步骤：

（1）倒平板

分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在 操作。

（2）制备土壤稀释液

取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL的无菌水的大试管中，依次稀释到107稀释度。

（3）涂布

按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL 进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布 个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布 个。

（4）培养

放入恒温箱内，在28～30℃下培养3～4 d。

（5）细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是 。（稀释度是105）

预期结果：

相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数 （填“多于”或“少于”）无氮培养基上的数目。原因是

。

答案 步骤：（1）酒精灯火焰旁 （3）3 1

（5）30～300 5×107

预期结果：多于 无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存

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