[直击考纲]　1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。4.利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用。5.酶活力测定的一般原理和方法。6.酶在食品制造和洗涤等方面的应用。7.制备和应用固相化酶。8.从生物材料中提取某些特定的成分。9.运用发酵加工食品的基本方法。10.测定食品加工中可能产生的有害物质。11.蛋白质的提取和分离。

考点33　微生物的利用及在传统发酵技术中的应用

题组一　微生物的利用

1．(2016·全国乙，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是______________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

答案　(1)牛肉膏、蛋白胨　琼脂

(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间

(3)污染　不正确

解析　(1)牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。

2．(2016·全国丙，39)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：

(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________________和________________。分离纯化时应挑选出____________的菌落作为候选菌。

(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。

答案　(1)无菌水　泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落　(2)鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸(或酸)　具有透明圈　(3)甘油

解析　(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释；进行梯度稀释的理由是在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的乳酸菌将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。(2)在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸和利于乳酸菌的鉴别和分离；分离纯化时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时应使用甘油管保藏法，故菌液中常需要加入一定量的甘油。

3．(2014·新课标全国Ⅱ，39)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：

(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为______________。

(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_________________

________________________________________________________________________。

(3)在示意图A和图B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高____________的利用率。

答案　(1)检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107

(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落

(3)B　(4)溶解氧　营养物质

解析　(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有(39＋38＋37)/3＝38个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.1＝380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为380×100＝3.8×104，则每升水样中活菌数目为3.8×104×1 000＝3.8×107。(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。

题组二　传统发酵技术中的应用

4．(2016·全国甲，39)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的，回答下列问题：

(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的________________中进行，其产物乙醇与____________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的____________中进行，与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度____________。

(2)第二阶段是在醋酸菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸菌的呼吸作用类型，该过程需要在________条件下才能完成。

(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度________(填“低于”或“高于”)第二阶段。

(4)醋酸菌属于____________核生物，其细胞结构中__________(填“含有”或“不含有”)线粒体。

答案　(1)细胞质基质　重铬酸钾　线粒体　快

(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有

解析　(1)图示中的过程①和②分别表示无氧呼吸的第一、第二阶段，其场所均为细胞质基质；橙色的重铬酸钾溶液，在酸性条件下与乙醇(酒精)发生化学反应，变成灰绿色。过程③表示有氧呼吸的第二、第三阶段，其场所分别为线粒体基质和线粒体内膜，即在酵母菌细胞的线粒体中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度快。(2)醋酸菌是一种好氧菌，在氧气充足的条件下才能进行旺盛的生命活动，因此将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，需要在有氧条件下才能完成。(3)第一阶段即果酒的制作，所控制的温度范围是18～25 ℃，第二阶段即果醋的制作所控制的温度范围是30～35 ℃，所以第一阶段的温度低于第二阶段。(4)醋酸菌属于原核生物，其细胞结构中不含线粒体等复杂的细胞器。

5．(2013·新课标全国Ⅰ，39)回答下列有关泡菜制作的习题：

(1)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是__________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的目的是_______________________。

(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行________________的过程。该过程发生在乳酸菌细胞的______________中。

(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有______、__________和__________等。

(4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是________________________________，原因是__________________

________________________________________________________________________。

答案　(1)杀灭杂菌　增加乳酸菌数量　(2)无氧呼吸　细胞质　(3)温度　腌制时间　食盐用量　(4)乳酸菌数量增多，杂菌数量减少　乳酸菌比杂菌更为耐酸

解析　根据泡菜制作过程中乳酸菌的来源、呼吸类型、呼吸产物所引起的环境变化回答相应问题，还要注意每步操作的目的以及一些相关物质的变化。

1．微生物的培养

(1)无菌技术：主要包括消毒和灭菌。

①消毒方法：常用煮沸消毒法、巴氏消毒法。

②常用灭菌方法：灼烧灭菌——接种环、接种针等金属器具；干热灭菌——主要针对玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌——主要针对培养基等。

(2)如图为倒平板操作过程，操作时要待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。

制备固体培养基最后要将平板倒置，其主要目的是防止培养皿皿盖上的水珠滴入培养基造成污染。

(3)平板划线操作

(4)稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。如图所示：

2．某种微生物的分离与计数

(1)分离——选择培养基

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺乏氮源时，可以分离得到固氮微生物。

④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。

⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。

(2)计数

①土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

a．筛选菌株：利用以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选菌株。

b．计数方法：活菌计数法和显微镜直接计数法。前者为了增强实验的说服力和准确性，需设置重复组，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

c．过程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

②分解纤维素的微生物的分离

a．实验原理

即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

b．流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌落。

(3)鉴定方法

3.微生物在传统发酵技术中的应用

考向一　微生物的培养、分离与选择

1．(2016·江苏，25)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(多选)(　　)

A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品

B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落

C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化

D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株

答案　BC

解析　漆酶降解“木质”，则漆酶菌株多存在于“木质”丰富的场所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。

2．(2016·四川，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以__________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加__________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为__________，突变基因表达的蛋白质含__________个氨基酸。

答案　(1)尿素　酚红　红　(2)稀释涂布平板法　1.75　少　(3)UGA　115

解析　(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，故图中选择培养基应以尿素作为唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。(2)用于计数细菌菌落数的接种方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中的细菌数量为(156＋178＋191)/3÷0.1×105＝1.75×108。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，故用此方法测得的细菌数偏少。(3)密码子由三个相邻的碱基组成，271个碱基和后面2个碱基一起共构成91个密码子，插入的70个核苷酸和后面2个碱基一起共构成24个密码子，紧随其后是UGA，应为终止密码，翻译结束，因此表达的蛋白质含115个氨基酸。

3．(2014·四川，10)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。

(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_____________________________

________________________________________________________________________。

(2)与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基常需添加生长素和________________，这些植物激素一般需要事先单独配制成________保存备用。

(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有___________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是_____________________，该实验设计是否合理？为什么？______________

________________________________________________________________________。

答案　(1)氮源和无机盐　只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖　(2)细胞分裂素　母液　(3)接种环　①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始

(4)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质　不合理，缺少空白对照

解析　(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基需要添加生长素和细胞分裂素，用于调节植物细胞再分化；这些植物激素一般需要事先单独配制成母液保存备用。(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。划线的平板培养后，发现第一划线区域的划线上不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，而其他划线上有菌落。造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域第一条线时未从第一区域末端开始。(4)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的空白对照。

考向二　传统发酵技术的应用

4．(2016·江苏，7)下列关于中学“腐乳的制作”实验，叙述正确的是(　　)

A．加盐主要是为了调节水分，利于毛霉生长

B．加料酒主要是为了灭菌，避免腐乳变质

C．发酵过程中起主要作用的是乳酸杆菌

D．实验室制作的腐乳不宜直接食用

答案　D

解析　加盐主要是为了抑制微生物生长，防止豆腐腐败变质，A错误；加料酒主要为了使腐乳具有独特的香味，B错误；发酵过程中起主要作用的是毛霉，C错误；实验室制作的腐乳可能灭菌不彻底，不宜直接食用，D正确。

5．红方是腐乳的一种。请回答与其制作有关的下列问题：

(1)补充制作红方的实验流程：①__________________→②加盐腌制→③______________→④密封腌制。

(2)在实验流程①中，首先将豆腐块平放在笼屉内，笼屉中的温度应控制在____________℃，并保持一定的________。5天后豆腐块表面布满毛霉菌丝，这些毛霉来自空气中的______________。

(3)在实验流程②操作中，向长满毛霉的豆腐块加盐，其作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬。同时，盐还能____________________________，避免豆腐块腐败变质。

(4)在实验流程③用到的辅料中，卤汤是由________及各种__________配制而成的。此外，红方因加入了______而呈深红色。

答案　(1)豆腐上长出毛霉　加卤汤装瓶

(2)15～18　湿度　毛霉孢子

(3)抑制微生物的生长

(4)酒　香辛料　红曲

解析　(1)制作红方的实验流程：①豆腐上长出毛霉→②加盐腌制→③加卤汤装瓶→④密封腌制。

(2)在实验流程①豆腐上长出毛霉中，首先将豆腐块平放在笼屉内，笼屉中的温度应控制在15～18 ℃，并保持一定的湿度。5天后豆腐块表面布满毛霉菌丝，这些毛霉来自空气中的毛霉孢子。

(3)在实验流程②加盐腌制操作中，向长满毛霉的豆腐块加盐，其作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬。同时，盐还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。

(4)在实验流程③加卤汤装瓶用到的辅料中，卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。此外，红方因加入了红曲而呈深红色。

6．葡萄酒和葡萄醋深受人们的喜爱。请根据利用葡萄汁生产葡萄酒和葡萄醋的实验，回答下列问题：

(1)某实验小组尝试使用罐头瓶在常温(21±3) ℃下制作葡萄酒。开始时，向消过毒的罐头瓶中加入新鲜的葡萄汁。葡萄汁装入瓶中时，要留出大约的空间，酵母菌进行呼吸作用的方式有________________________。在以后的过程中，每隔12 h左右，要将瓶盖拧松一次(不是打开瓶盖)，此后再拧紧。拧紧瓶盖时，酵母菌进行呼吸作用方式的总反应式是____________________________________________。

(2)从野生酵母菌群中分离纯化酵母菌，常使用的接种方法是平板划线法和_____________________两种。若要想计数酵母菌活菌的个数，使所得的估计值更接近实际值，除应严格操作和多次重复外，还应经过____________的过程，保证待测样品的浓度比较合适。

(3)在果汁加工过程中，可添加______________________酶来提高出汁率和清澈度。葡萄的皮、子中含有原花青素、葡萄皮红素和大量葡萄风味物质等，这些物质易溶于乙醇和乙酸乙酯中，因此，常采用________的方法来分离提取。

(4)醋酸菌是生产葡萄醋必用的菌种，可以从食醋中分离得到纯化的醋酸菌。扩大培养醋酸菌时，为了防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养基上造成污染，一般是等待平板冷却凝固后将____________进行培养。

(5)酵母菌和醋酸菌中，属于原核生物的是____________。

答案　(1)有氧呼吸和无氧呼吸　C6H12O62CO2＋2C2H5OH＋能量

(2)稀释涂布平板法　稀释(或梯度稀释)

(3)纤维素酶、果胶　萃取

(4)平板倒置

(5)醋酸菌

解析　(1)酵母菌进行呼吸作用的方式有有氧呼吸和无氧呼吸。拧紧瓶盖，酵母菌进行无氧呼吸，总反应式是：C6H12O62CO2＋2C2H5OH＋能量。

(2)从野生酵母菌群中分离纯化酵母菌，常使用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法两种。若要想计数酵母菌活菌的个数，使所得的估计值更接近实际值，除应严格操作和多次重复外，还应经过系列稀释(或梯度稀释)的过程，保证待测样品的浓度比较合适。

(3)在果汁加工过程中，可添加纤维素酶、果胶酶来提高出汁率和清澈度。葡萄的皮、子中含有原花青素、葡萄皮红素和大量葡萄风味物质等，这些物质易溶于乙醇和乙酸乙酯中，因此，常采用萃取的方法来分离提取。

(4)扩大培养醋酸菌时，为了防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养基上造成污染，一般是等待平板冷却凝固后将平板倒置进行培养。

(5)醋酸菌是原核生物，酵母菌是真核生物。

7．生物技术在日常生活中应用非常广泛，回答下列与生物技术有关的问题：

(1)泡菜不能急着吃，是因为泡菜制作过程中会产生亚硝酸盐，实验室常采用________法来检测泡菜中亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐在适宜条件下可以和相关试剂反应生成__________色染料。

(2)各地制作腐乳的原料和菌种相同，但风味迥异，主要是通过控制______________来实现的。

(3)制作果醋和葡萄糖酒使用的微生物在结构上不同，主要是前者_______________。

答案　(1)比色　玫瑰红　(2)发酵的条件　(3)无成形的细胞核或无核膜

解析　(1)实验室常采用比色法来检测泡菜中亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐在盐酸酸化条件下可以和对氨基苯磺酸反应生成玫瑰红色染料。

(2)各地腐乳风味迥异，在原料和菌种相同时，可通过控制发酵的条件制作出不同风味的腐乳。

(3)制作果醋时使用的醋酸菌是原核生物，由原核细胞组成，没有成形的细胞核；制作果酒时的菌种酵母菌为真核生物，由真核细胞组成，有成形的细胞核。

2019高考生物考前复习考点33 微生物的利用及在传统发酵技术中的应用