小分子荧光探针在蛋白质标记与成像分析中的应用

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http:ΠΠwww.hxtb.org　　　　　　　　　　化学通报　2007年第7期・507・
小分子荧光探针在蛋白质标记与成像分析中的应用
何晶　石景　傅尧
#
3
(中国科学技术大学化学系　合肥　230026;#兰州大学化学系　兰州730000
摘　要　小分子荧光探针由于其体积小、合成简单等特点在蛋白质成像技术中扮演着越来越重要的角色。此领域的研究融合了生物化学、有机合成、分析化学等相关学科,是当今化学发展的一个重要方向,有着广阔的前景。目前,能够专一性地与目标蛋白质(POI结合的小分子探针较少,设计和合成方法的缺乏已经成为制约该领域进一步发展的瓶颈。本文概括地介绍了近年来出现的一些小分子荧光探针,关注它们在活体标记中的应用。
关键词　小分子探针　荧光成像　蛋白质标记
Small2moleculeFluorescentProbesinProteinLabelingandImagingAnalysis
HeJing,ShiJing,Fuyao
#
#
3
(DepartmentofChemistry,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026;
DepartmentofChemistry,LanzhouUniversity,Lanzhou730000
Abstract　Withseveraldistinctivecharacteristicssuchasasmallsizeandsimplesynthesis,thesmall2moleculefluorescentprobeisofincreasingimportanceintheproteinimagingtechnology.Thisfieldisacross2discipline,combiningbiochemistry,organicsynthesisandanalyticalchemistry,asignificantdirectioninthedevelopmentofcurrentchemistrywithabrightprospect.Recently,ashortageofpropermethodologiesfortargetingsmall2moleculefluorescentprobeswithveryhighspecificitytoproteinsofinterest(POIhasbeentheprincipalbottleneck.Thepresentreviewhasincludedtherecentprogressinthisfield,especiallyfocusedonitsapplicationinvivo.
Keywords　Small2moleculeprobe,Fluorescentimaging,Labelingofproteins
蛋白质作为生物最重要的基本组成成分之一,与免疫、新陈代谢等各种生命活动息息相关。因此对蛋白质分布、蛋白质2蛋白质之间生物大分子的相互作用、反应动力学及化学微环境等方面的研究对了解生命活动的机理有着重大的意义。
近年来,随着蛋白质标记技术的不断发展与成熟,对蛋白质的研究进入了一个高速发展的阶段。一般来说,对蛋白质的标记分为活体内标记与活体外标记。对于活体外标记来说,需要将蛋白质纯化后进
[1]
行化学标记,再纯化后用一些侵害性的方法(例如显微注射将其再引入到活体细胞中去。然而这种方法对蛋白质进行标记的同时也引入了人为干扰,可能对蛋白质的功能产生一些不可消除的影响,会干扰细胞正常的功能。对蛋白质的标记希望在其自然状态下进行,并且尽可能的减少人为影响,这才能最真实地反映蛋白质的性质。因此对蛋白质进行活体内标记是目前最重要的思路。
1　绿色荧光蛋白质(GFP
　　绿色荧光蛋白质(GFP最初由Shimomura等在海洋生物水母Aequoreavictoria体内发现。从20世纪90年代起,GFP在荧光成像技术中广泛应用于蛋白质的标记和一些其它化合物的活体检测。作为一种良好的蛋白质荧光探针,GFP具有使用简单、不需任何外加底物或辅助因子、表达几乎不受种属范围的限制、易于得到性质不同的突变体、荧光稳定、无毒害性等优点。然而GFP由238个氨基酸组成,它较
国家自然科学基金资助项目(20602034
2006210220收稿,2007201223接受
[2]
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大的体积在活体标记中可能会影响被标记的蛋白质或细胞的正常生理功能。小分子荧光探针的出现可
以弥补这一缺陷。
2　小分子荧光探针
　　小分子荧光探针一般由两部分组成:荧光团以及与受体专一性高亲和力结合的配体。受体与目标蛋白质(POI融合,通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。总体说来,小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒;能够与受体专一性稳定结合,使得其在进行监测的较长时间(几个小时内保持稳定性;背景噪音水平尽可能的低;探针尽可能地设计成一定的模式,使得多种荧光团能够方便地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。对于受体的选择有以下两个要求:(1受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达;(2受体应该尽可能小,以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能,因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。而选择合适的受体2配体对可以实现对蛋白质高灵敏度高亲和力结合。一般说来,受体与配体的结合应当尽可能地快,有利于监测时间敏感性的生理过程。受体2配体的作用一般包括半抗原2抗体、生物素2抗生物素蛋白、酶2底物、联砷荧光物质与富含半胱氨酸的肽链之间的作用等。
211　FLAsH型探针
[3]
Tsien等提出了一种将荧光素的衍生物(FLAsH在活体细胞内与蛋白质位点专一性共价结合的方法(图式1。Cys2Cys2Xaa2Xaa2Cys2Cys序列(Xaa是非Cys的任意氨基酸融合或插入到目标蛋白质中,
具有细胞膜通透性的联砷2荧光素衍生物与序列专一性地识别,在每个砷原子与两个半胱氨酸的巯基共价结合后发出荧光。FLAsH能够很方便地在钯催化的条件下,通过三氯化砷与荧光素的醋酸汞盐的转金属化作用一步得到,而且通过加入1,22乙二硫醇(EDT很好地加以分离,得到没有荧光的产物FLAsH2EDT2。但是当与砷原子共价结合的EDT被Cys2Cys2Xaa2Xaa2Cys2Cys序列中的巯基替代后,荧光强度增强约50000倍。FLAsH2EDT2的荧光淬灭可以用震动失活或光诱导的电子转移机理来解释,而结构较为
[4]
固定且刚性较大的多肽链能阻止荧光的淬灭。此外,除了绿色的FLAsH,红色的ReAsH和蓝色的HoXAsH、CHoAsH等多种衍生物也已被成功合成。
图式1　FlAsH的标记反应
Scheme1　ThelabelingreactionofFlAsH
基于FlAsH的蛋白质标记体系存在很多优点。首先,当联砷衍生物与POI结合后,它的荧光显著增强,同时背景干扰也明显减弱;其次,Cys2Cys2Xaa2Xaa2Cys2Cys序列分子量相对较小,它不仅可以与蛋白质的N端或C端作用,还可以融入蛋白质的环或α螺旋的外表面,并且基本不会影响POI的功能,已经有不少实验证明联砷衍生物的标记对蛋白质的功能影响远小于GFP,例如酵母中的微管蛋白、受体与G蛋白的结合
[6]
[5]
、染色体向核的移位以及细菌向真核细胞分泌的病原体蛋白质
[4]
[7][8]
。联砷衍生物还能等。联砷与Cys2
对蛋白质进行一些GFP不能进行的操作,如亲和力纯化、荧光团协助的光失活
[9,10]
Cys2Xaa2Xaa2Cys2Cys序列之间的结合比较牢固,结合前后颜色的改变有利于在脉冲追踪实验中对融合
蛋白进行连续标记。另外,整个体系的荧光能够在电子显微镜下观测到。
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FLAsH体系也存在一些缺点。由于联砷与富含半胱氨酸的蛋白质存在非专一性作用,即使使用过
量的EDT,也会产生较高的背景荧光;无法做到在同一个细胞器中同时以不同的颜色分别标记两个不同的蛋白质;而且,由于受体上的半胱氨酸必须处于还原态,这样就很难对处于氧化环境的细胞进行标记。
[11]
Vogel等提出了一种新型的小分子探针,它由两部分组成,一部分为荧光基团,另一部分为由金属离子与含有三醋酸根的叔胺类化合物(NTA组成的螯合物(图式2。这种探针能够可逆、专一性地与POI的寡聚组氨酸序列结合。Vogel等用Ni2NTA标记在N端含有六聚组氨酸序列的GFP(GFP2His6。两者的结合在几秒钟之内即完成。Ni2NTA作为理想的FRET受体几乎完全淬灭了GFP的荧光。而且此反应的速度与Ni2NTA探针的浓度成正比关系,表明Ni2NTA与GFP2His6结合的比例系数为1Π1。特别要指出的是,Ni2NTA探针都是通过淬灭与POI连接的受体的荧光间接使用的。这是由于对与Ni2NTA直接相连的荧光基团的荧光成像相当困难,因为Ni会淬灭荧光并且Ni2NTA与寡聚组氨酸序列之间的
[12]
亲和力并不是特别高。同样是以氨基酸序列作为受体,这种探针优于FlAsH的地方是它可以用于氧
[13]
化环境中。
2+
图式2　Ni2NTA的结构
Scheme2　StructureofNi2NTA
212　AGT型探针
利用人类DNA修复蛋白的62О2烷基鸟嘌呤2DNA2烷基转移酶(hAGT的特性,提出了
另一种蛋白质荧光标记方法。AGT的氨基酸残基能识别62О2烷基鸟嘌呤,并且将烷基转移连接到自身的一个半胱氨酸的巯基上。AGT的底物识别性很广,能够识别很多种类的烷基,包括苯甲基。Johnsson
Johnsson等
[14]
等先将POI与hAGT融合,鸟嘌呤衍生物与作为标签的荧光团结合作为探针,hAGT半胱氨酸上的活性硫原子亲核进攻以苯甲基修饰的鸟嘌呤衍生物来完成两者间的结合(图式3。由于苯甲基鸟嘌呤与hAGT之间存在共价作用,结合比较稳定,可以在数小时内对hAGT融合蛋白进行观察。只有探针诱导的细胞内融合蛋白质降解对此过程有影响。由于hAGT与GFP相比,体积小31个氨基酸,因此对目标蛋白质的影响也大大减少。苯甲基鸟嘌呤的衍生物较多,到现在为止,已有20多种能够与AGT进行专一性标记,这是使用AGT标记方法的一个优势。然而值得注意的是,在哺乳动物的细胞中,内源的野生型AGT(wtAGT也会被苯甲基鸟嘌呤的衍生物识别,从而出现较高的背景标记。为了解决这一缺
[19]
陷,Johnsson等合成了一种wtAGT的抑制剂和一系列能抵抗此抑制剂的AGT变体。这样就能使得在这种抑制剂的存在下,wtAGT失活,而AGT变体能够对POI进行专一性标记。这种利用AGT变体和wtAGT抑制剂的方法有许多优势,例如组成AGT变体的氨基酸数为182,与hAGT(207相比有所减少;另
[14～18]
图式3　hAGT的标记反应
Scheme3　ThelabelingreactionofhAGT
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外AGT变体对于烷基化的DNA的亲和力低于hAGT,从而专一性得到提高,背景值得到降低。总的说
来,AGT及其变体对蛋白质进行标记具有专一性和很广的底物识别性,但是它的体积仍然较大,这是这种方法的一种内在缺陷。
213　HaloTag型探针
普洛麦格公司(Promega的研究者利用脱卤素酶(HaloTag的特性提出了一种在思想上与AGT融合蛋白质相似的新的蛋白质标记方法。野生型HaloTag能够与卤代的脂肪族化合物发生两步反应:HaloTag先发生亲核取代反应,脂肪族底物与天门氨酸盐形成酯(图式4,接着酯水解生成醇作为最终产物。这种方法专一性较好,然而HaloTag由293个氨基酸组成,体积比GFP大。根据类似的思想,利用一段短的肽链作为受体,可以设计出一些新型的小分子荧光探针。
[13]
图式4　HaloTag的标记反应
Scheme4　ThelabelingreactionofHaloTag
214　PCP、ACP型探针
[21]
和George提出了一种新的方法,这种方法是基于含有多肽链的蛋白质(PCP或是含有酰基
的蛋白质(ACP在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase的催化作用下对蛋白质进行专一性标记(图式5。PPtase将磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A(CoA上转移至ACP或PCP的一个精氨酸侧链上,形成专一性
Yin
[20]
的共价结合。这种方法已经被应用于在酵母菌和哺乳动物细胞中荧光标记α2凝集素受体(Aga2p和人
[21]
类G2蛋白结合的受体(NK1。这种探针具有较多的优点:标记速度较快;体积小,约由80个左右的氨基酸组成;对于不同种类的CoA衍生物,PPtase缺乏分辨力,因此可以应用多种标记方式。
图式5　CP化合物的标记反应
Scheme5　ThelabelingreactionofCPcompounds
215　DHFR型探针
提出一种以二氢叶酸还原酶(DHFR作为受体的蛋白质活体标记方法。DHFR是一种
含有157个氨基酸的单体酶,能够被DHFR抑制剂荧光标记。甲氨蝶呤(Mtx与DHFR的结合具有很高的亲和力。另外,Mtx能够抑制DHFR的蛋白水解,并且Mtx在γ2羧基处被化学修饰后并不改变其与DHFR结合的性质。因此可以利用这一特性,将DHFR与目标蛋白质结合后,用与荧光素结合的Mtx对
[1][23]
蛋白质进行标记。Cornish等进一步用三甲氧苄二氨嘧啶(TMP选择性标记与E.coli.eDHFR融合
Cornish等
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[22]

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的蛋白质,反应显示出很低的背景荧光值和快速的动力学性质。
216　F36V型探针
提出了一种利用FKBP12的变体(F36V与相应的联有荧光团的配体(FL2SLF高亲和力地结合为基础的化学标记蛋白质方法(图式6。FKBP12含有108个氨基
Marks等
[24]
酸。在哺乳动物细胞中,FL2SL与F36V融合的蛋白质标记,可以用来监测亚细胞定位,并且在F36V融合的蛋白质表达水平很低的情况下也能容易地检测出两者之间的结合。另外,荧光的强度与F36V融合的蛋白质的表达水平成比例。
图式6　FL2SLF的结构
Scheme6　StructureofFL2SLF
217　抗体、抗生物素蛋白型探针
最早报道了利用半抗原2抗体的结合作用设计分子探针,他们选择单链的抗体sFv作为
[26]
受体,半抗原phOx作为配体,测量了高尔基体内腔的pH。与他们的研究相似,Wu等利用生物素2抗生物素蛋白的作用,测量了细胞器的pH。然而,通过抗体和抗生物素蛋白对普通的细胞内蛋白质进行标记时,效果不是很理想。Farinas也指出,自己所研究的抗体在还原环境的细胞中不能很好地表达。另
Farinas等
[25]
一方面抗生物素蛋白是63kDa的四聚体,它过大的体积会对目标蛋白质的功能有所影响
[1]
。
218　“Click”反应型探针
提出,被叠氮修饰的细胞表面的蛋白质能与和荧光团相连的炔在一价铜的催化作用下
(Click”发生Huisgen1,32偶极环加成“反应反应而被标记(图式7。
Tirrell等
[27]
图式7　应用“Click”反应标记蛋白质
Scheme7　Labelingofproteinsbasedonthe“Click”reaction
该反应能在水相中进行。如图式8所示,此类反应的关键在于一价铜催化下炔与叠氮的成环作用。
[28]
Sharpless等对这类反应研究得很多。该反应的特点是:反应所需的条件较温和、产量较高、反应速度
[29]
较快。并且Finn等已经证明了该反应具有普遍的生物适应性。
图式8　“Click”反应
Scheme8　“Click”reaction
3　结语
　　蛋白质领域的不断探索推进了小分子荧光探针的快速发展,随着越来越多性质良好的小分子荧光
探针的出现,人类对蛋白质的研究也将达到一个新的高度。通过最近几年的研究,国外相关的研究小组已经在该类探针的设计和合成上积累了大量的理论与实验基础,为以后进一步的改进和创新铺平了
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道路。从本文中介绍的这9种小分子蛋白质荧光探针可以看出,它们虽然具有各自相应的优缺点,但都
是基于受体与配体之间的相互识别作用。在将来的工作中,设计并开发出理想的受体2配体对,使得该类型探针在保证其体积较小的前提条件下也能同时满足高亲和力、高专一性标记的要求,有着十分重要的价值和应用前景。另外,如何能够在同一个细胞中用相同或不同的手段进行多标记操作也是相当有意义的课题。
参
考
文
献
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何晶
1985年4月生于四川成都
傅尧
1977年7月生于重庆
2005年获中国科学技术大学化学系博士学位
现系中国科学技术大学化学系本科生现从事小分子pH荧光探针的研究
E2mail:hejing19@mail.ustc.edu.cn
现系中国科学技术大学化学系副教授从事计算有机化学和物理有机化学领域研究
E2mail:fuyao@ustc.edu.cn
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